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弱毒株交叉保护作用是防治植物病毒病的重要手段。如何获得有效弱毒株是交叉保护作用的关键因素。本研究通过对马铃薯Y病毒属病毒(强、弱毒株)的全长及部分氨基酸序列比对分析,筛选出在亲本强毒株PRSV-LM的P1和HC-Pro基因上的8个可能与致病性相关的氨基酸突变位点(1309、K481、K598、R728、F753、L754、N787和D944)。采用定点突变技术和Gibson拼接法,分别构建了 4种含有2个突变位点(L754和N787)、4个突变位点(I309、K481、F753和D944)、6个突变位点(1309、K481、F753、L754、N787 和 D944)和 8 个突变位点(1309、K481、K598、R728、F753、L754、N787 和 D944)的 PRSV-LM 全长 cDNA 克隆突变体:pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8。并在强毒株pPRSV-LM的HC-Pro和CP基因之间插入gfp基因,构建含gfp基因的强毒株pPRSV-LM-GFP/CP。构建的5种PRSV-LM全长cDNA克隆经人工接种、病症观察和RT-PCR检测以及荧光检测,结果表明5种PRSV-LM全长cDNA克隆均具有系统侵染性。对突变体pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8接种后15周症状观察结果显示,pPRSV-LM-GFP/CP 和 pGprsvm2 具有与 pPRSV-LM 类似病症。pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8在番木瓜植株上的病症远弱于pPRSV-LM,其严重程度出现依次减弱,尤其pGprsvm8的病症最弱。结合四种突变体克隆的症状表现与其在PRSV-LM的P1和HC-Pro基因上的8个突变位点分析,验证K598→E和R728→I可能是影响致病性的关键位点。在获得病症明显减弱的三种弱毒株pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8后,分别进行强毒株pPRSV-LM攻毒实验来验证三种弱毒株对亲本强毒株的交叉保护效果。采取保护接种后间隔0天、20天、30天、40天的不同时间段进行以强毒株pPRSV-LM的攻毒实验,经过攻毒后0天、14天、21天、30天、50天、60天的症状观察,显示强弱毒株间隔0天,病症表现有类似甚至强于亲本强毒株的严重病症发生,无交叉保护效果。间隔时间超过20天攻毒,病症表现明显比单独接种亲本强毒株弱,具有更好交叉保护效果。pGprsvm4保护接种后的番木瓜苗,攻毒后有稍明显病症发生,pGprsvm6和pGprsvm8作为保护病毒,攻毒后的番木瓜苗无明显病症发生,具有较好的保护效果。以pGprsvm6和pGprsvm8作为保护病毒验证其对强毒株pPRSV-LM-GFP/CP的保护作用,采取保护接种后间隔10天、20天、30天、40天不同时间段进行强毒株pPRSV-LM攻毒并记录攻毒后0天、14天、21天、30天、50天症状观察,显示pGprsvm6的保护作用属于不完全保护作用,攻毒后出现轻微病症;pGprsvm8几乎具有完全保护作用,攻毒后无明显病症发生。并对攻毒后的番木瓜苗在荧光显微镜观察和紫外灯下发光检测、RT-PCR检测及测序分析,显示攻毒后的番木瓜苗仅检测到保护毒株,攻击病毒则无,说明,保护毒株阻碍了攻击病毒的二次侵染,攻毒后无共侵染现象发生。