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近年来发现了一类新的CRISP家族蛋白,它们的特征是在进化上保守,拥有高度的序列同源性,尤其是一级序列包含16个严格保守的半胱氨酸残基。此家族蛋白在蛇毒中也广泛存在,已有的研究表明蛇毒中此家族成员能够抑制CNG通道和L-Ca2+通道。因此推测它们可能组成一类新型的离子通道阻断剂。中华眼镜蛇毒经两步柱层析可纯化出一种新的CRISP家族成员,命名为natrin,在天然状态下以单体形式存在。SDS电泳和质谱检测,该蛋白的分子量为25kDa左右。根据测定的N端序列和其它蛇毒的同源蛋白的高度保守序列设计了引物,首次从蛇腺中克隆natrin全长CDNA,共1296bp,其中720bp为蛋白编码框,编码239个氨基酸残基,N-端18个氨基酸序列为信号肽序列。全长序列比对显示它和其他种属的蛇毒CRISP蛋白有很高的同源性。根据其它种属的蛇毒CRISP蛋白对于离子通道的抑制效应的报道,我们测试了natrin对于鼠胸主动脉血管环的基础收缩和高钾诱导收缩的效应,结果显示它可以引起去极化的血管环进一步收缩,但不影响血管环基础收缩。随后利用全细胞膜片钳技术,结果发现natrin可以抑制大电导钙活化的钾(BKCa)电流,并且浓度抑制曲线拟合结果显示其半效应的抑制浓度IC50为34.4nM,Hill系数为1.02,暗示natrin可能和BKCa通道以1:1摩尔比结合,这种结合比例和其他CRISP蛋白对于离子通道抑制的结果相一致。
为了进一步探索natrin蛋白和离子通道的结合机理,我们对natrin的三维结构进行了研究。在高盐的溶液中获得了单晶,并且收集到2.1A分辨率的晶体衍射数据,晶体的空间群为P212121,一个不对称单位由A,B和C三个分子组成。利用分子置换的方法获得了相位,修正了natrin的晶体结构。结构分析表明,晶体的一个非晶体学对称单位中的三个分子形成了环形三聚体结构。单体的结构由两个结构域-PR-1结构域和CRD结构域组成,两个结构域之间由一段稳定的铰链区域相连。结构显示此家族典型的16个半胱氨酸完全配对形成8对二硫键,其中3对在PR-1结构域,2对在铰链区,3对在CRD结构域中。模型中三体的结构比较分析显示,他们的构象发生了轻微的变化,即两个结构域之间相对取向不尽相同,尤其是对于分子C表现出较大的变化。这暗示了CRISP蛋白在溶液中的柔性状态,结构域之间可以发生相对运动,这种柔性将有利于其CRD参与蛋白-蛋白的相互作用。
先前的功能研究结果显示CRISP家族中的离子通道阻断剂可能是通过一段关键的残基与通道相互作用的。以CRISP家族成员stecrisp和natrin三维结构为模型,结构分析显示这些关键的功能性残基位于CRD的loopl区域。此loop参与形成了两个结构域之间弱的相互作用界面。一级序列比对显示此家族中组成此loop的残基是高度可变的。natrin和stecrisp三维结构比较也表明此区域的结构差异。这可能为此家族的部分蛋白对于不同配体的选择性提供了结构基础。
另外,结构分析显示natrin的CRD结构非常类似于抑制钾离子通道的肽毒素ShK和BgK。已有大量的研究揭示这些肽毒是通过位于一段helix的相邻“功能性双残基”和离子通道的孔道区域相互作用,从而抑制K+离子的运输。结构分析显示natrin的CRD相应区域未发现类似的功能性残基,因此推测natrin和离子通道的作用不同于这两种毒肽作用方式。有趣地是,分析表明在natrin的CRD结构域中几乎所有的带正电的残基分布于一个平面上,此平面中心的两个残基的空间构象类似于典型的结合钾离子通道的功能性双残基,推测natrin也可能通过此区域和钾离子通道进行作用。这种推论有待于实验的进一步的验证。