论文部分内容阅读
牛肉中的肌内脂肪含量可以直接影响了牛肉嫩度和风味，增加牛肉中肌内脂肪含量可以改善牛肉的品质。而机体脂肪组织含量又是脂肪细胞中甘油三酯积累量的宏观体现。此外，研究发现动物脂肪的沉积与脂肪代谢是受多种转录因子调控的复杂生理过程。脂肪细胞甘油三酯水解酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）可以特异性的脂解甘油三酯，并将甘油三酯水解为甘油二酯，是调控细胞中甘油三酯和脂肪酸之间平衡的关键因子。目前，关于ATGL对牛前体脂肪细胞中的甘油三脂积累影响及其调控机理仍不清楚。为了探索牛ATGL基因的功能，本研究以牛ATGL基因为目标基因，以牛前体脂肪细胞为实验对象，以腺病毒介导的基因过量表达技术和shRNA干扰技术为手段，直接发掘牛GL基因在牛前体脂肪细胞甘油三脂积累过程中的重要作用。同时，在转录水平上初步探索目标基因对一些重要的脂肪细胞分化、脂肪合成及代谢相关基因的影响。主要研究成果如下：（1）克隆得到秦川牛ATGL基因的CDS区序列，并研究了其在牛脂肪细胞诱导分化过程中的mRNA表达规律。（2）构建了牛ATGL基因的腺病毒过表达载体，并包装获得了高滴度重组腺病毒，建立了适合于牛脂肪细胞的腺病毒过表达载体系统。（3）设计了4对牛ATGL基因的shRNA并成功构建了牛ATGL基因的腺病毒干扰载体，并包装获得了高滴度重组腺病毒，建立了适合于牛脂肪细胞的腺病毒过表达载体系统。（4）实现了对牛ATGL基因的mRNA表达量的调控，并得出脂肪细胞中甘油三脂的量与牛ATGL基因的表达量成正相关。油红O染色结果显示，过量表达牛ATGL基因，对细胞的分化有一定得负调控作用，细胞中脂滴明显减少。沉默脂肪细胞中的ATGL基因表达量，促进了脂肪细胞的分化，同时细胞中的脂滴明显增多。脂肪细胞中甘油三脂检测结果显示，过量表达牛ATGL基因，脂肪细胞中甘油三脂的量与对照组相比减少沉默脂肪细胞中的ATGL基因表达量，脂肪细胞中甘油三脂的量与对照组相比增加。（5）过量表达ATGL基因可下调过氧化物酶体增殖激活受体-gamma（PPARα）基因、和肝素受体（LXR）、硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）、脂肪酸转运蛋白-1（FATP1）、脂蛋白脂酶（LPL）、补体D（CFD）基因和固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP1）的mRNA表达量，而过量表达ATGL基因对C/EBPα基因的表达无明显影响；此外，过量表达ATGL基因可以上调脂肪酸合成酶（FAS）、瘦素瘦体基因（LEPR）、脂联素（ADI）、激素敏感酯酶(HSL)、CGI-58和脂滴包被蛋白PERILIPIN1基因表达量。（6）沉默脂肪细胞中的ATGL基因的表达量可下调脂肪细胞分化及代谢相关基因的mRNA表达量，如固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP1）、瘦素瘦体基因（LEPR）、脂联素（ADI）、激素敏感酯酶(HSL)基因；此外沉默脂肪细胞中的ATGL基因的表达量可上调过氧化物酶体增殖激活受体-gamma（PPARα）基因、肝素受体（LXR）、硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）、脂肪酸转运蛋白-1（FATP1）、脂肪酸合成酶（FAS）、CGI-58和脂滴包被蛋白PERILIPIN1基因，而对C/EBPα基因和LPL基因无明显影响。综上所述，本研究利用腺病毒过表达技术及shRNA干扰技术介导牛ATGL基因过量表达及部分沉默表达，首次研究了牛脂肪细胞中的甘油三脂积累随ATGL基因表达量改变的变化情况。同时，在转录水平上初步探索了TGL基因对甘油三脂调控的可能原因，及其对一些重要的脂肪细胞分化及脂肪合成代谢相关基因的调控作用，为进一步研究牛体内脂肪的形成与沉积提供一定的理论依据，为下一步培育转基因牛的相关科研工作奠定基础。