【摘 要】
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轮状病毒（Rotavirus,RV）可感染多种动物,并由于其分段基因组特征可以发生交叉重配,从而实现跨物种传播。近年来,关于RV在不同动物间,在人与犬之间的跨物种传播报道越来越多,而国内相关研究较少。随着国内伴侣犬饲养数量的增加,RV在犬与其他物种间跨种传播的风险也在增加。犬轮状病毒（Canine rotavirus,CRV）、犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）和犬
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轮状病毒（Rotavirus,RV）可感染多种动物,并由于其分段基因组特征可以发生交叉重配,从而实现跨物种传播。近年来,关于RV在不同动物间,在人与犬之间的跨物种传播报道越来越多,而国内相关研究较少。随着国内伴侣犬饲养数量的增加,RV在犬与其他物种间跨种传播的风险也在增加。犬轮状病毒（Canine rotavirus,CRV）、犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）和犬冠状病毒（Canine coronavirus,CCoV）是引起犬腹泻症状相关的主要RNA病毒,为了提高临床检测灵敏性和便捷性,本研究建立了多重荧光定量RT-PCR方法,特异性鉴别诊断犬轮状病毒的感染,区分检测犬瘟热、犬冠状病毒的感染。同时,本研究开展CRV分离鉴定和遗传变异分析工作,对分离毒株的全基因组11个节段编码区进行测序并构建各基因片段的进化树,研究其遗传进化关系,以及CRV与人和其他动物源RV的交叉重配关系。主要研究成果如下:1、CRV、CDV、CCoV多重荧光定量RT-PCR的建立针对CRV VP6基因、CDV N基因和CCoV M基因碱基序列保守区设计引物与探针,建立能同时检测这些病原的多重荧光定量RT-PCR方法。经过对反应各因素进行验证和优化后,结果表明,多重荧光定量RT-PCR反应特异性强,能够鉴别诊断3种病毒的感染。其CRV、CDV和CCoV最低检测下限分别为90.80 copies/μL、17.00 copies/μL和9.75 copies/μL;对其他病原无扩增信号,特异性强;重复性试验表明该方法组内和组间变异系数都小于5.00%,重复性良好,可应用于临床检测。2、CRV、CDV、CCoV检出率2019年10月-2021年5月期间,本研究对湖北省武汉市、十堰市、襄阳市的6家动物医院及流浪犬基地收集的338份犬腹泻样本（粪便251份,直肠拭子87份）,采用建立的多重荧光定量RT-PCR方法检测CRV、CDV和CCoV。结果显示CRV、CDV和CCoV阳性率分别为20.10%（68/338）、26.00%（88/338）和18.90%（64/338）。为了解CRV在犬中感染情况、基因类型和遗传特征以及与人和其他动物源RV交叉重配关系,本研究进一步开展了CRV分离鉴定及其遗传进化的相关研究。3、CRV分离与鉴定本研究首先确定了MA-104细胞的胰酶最佳维持浓度为4μg/m L,样品的胰酶激活浓度为20μg/m L。将预处理后的样品接种于MA-104细胞,盲传3代后,经RT-PCR和IFA鉴定确定分离到1株可稳定传代的CRV,命名为RVA/Canine-tc/CHN/WH/2020/G3P[3]。该病毒接种MA-104细胞约12 h后可引起细胞聚集、拉网和脱落等明显的细胞病变。该毒株在MA-104细胞中的病毒滴度可达107.8TCID50/m L。4、CRV全基因组CDS测序与重配分析对本研究的分离株RVA/Canine-tc/CHN/WH/2020/G3P[3]进行全基因组编码区扩增和测序,绘制各基因片段的基因进化树。经全基因组CDS测序后,确定该分离毒株基因型为G3-P[3]-I3-R3-C3-M3-A9-N2-T3-E3-H6,是基因类群Cat 97-like（VP4、NSP1、NSP2和NSP5）和AU-1-like（其他7个基因）的重配毒株。基于基因进化树分析结果表明VP7、VP6和VP4基因片段,分别与HRV（PB1048/Brazil）、HRV（12638/Japan）和人类污水中RVA（B24-R3/China）亲缘关系最近。提示了该分离株在人-犬之间可能存在基因重配和跨物种传播现象。综上所述,本研究建立了CRV、CDV、CCoV多重荧光定量RT-PCR检测方法,为犬腹泻病的诊断提供了技术支持,为流行病学调查及其分布规律研究奠定了基础,使用该方法调查了湖北省部分地区犬腹泻病毒流行情况。并分离到1株地方特征的CRV毒株,遗传进化分析表明其可能是AU-1-like和Cat 97-like轮状病毒的重配毒株,提示了RV在人与犬之间存在着跨种传播的风险。
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