禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）是重要的人兽共患病病原。禽流感给禽类养殖业造成严重经济损失,同时威胁人类健康。禽流感病毒的复制严格依赖宿主细胞。病毒与宿主蛋白的相互作用存在于病毒复制的每一个过程,是病毒完成感染、复制、致病以及跨种感染等过程的重要机制之一。而禽流感病毒PB1蛋白是病毒聚合酶的中心,包含一个RNA依赖性的RNA聚合酶（RdRp）活性结构域,具有聚合酶活性。可以与vRNA和cRNA结合。PB1的N端与PA互作,C端与PB2互作。因此筛选与PB1相互作用的宿主蛋白,对揭示禽流感病毒的生物学功能有重要意义。本研究通过质谱初筛与禽流感病毒PB1相互作用的宿主因子,发现禽类NUP93蛋白与流感病毒PB1相互作用,促进流感病毒在鸡胚成纤维细胞DF-1上的复制。过表达NUP93可以增强流感病毒聚合酶活性,同时促进流感病毒NP入核。主要研究内容如下:1.筛选与流感病毒PB1互作的禽源宿主因子在DF-1细胞上转染HA-PB1质粒后,使用抗HA免疫磁珠垂钓互作蛋白。垂钓样品利用SDS-PAGE电泳和银染分析,将样品洗脱液和差异条带进行质谱分析。初步筛选到62种蛋白与PB1相互作用。我们根据质谱结果挑选了综合评分较高的5种蛋白进行验证,分别是NUP93、NPEPPS、TPM3、VIM和NPM1。针对每个基因设计三条si RNA,分别沉默上述基因,检测其对流感病毒的增殖影响。实验结果表明,沉默NUP93后对流感病毒具有明显的抑制作用,而其余基因无显著影响。2.NUP93与PB1互作并且促进流感病毒的复制免疫共沉淀结果表明,共转染NUP93-Flag和HA-PB1质粒时,分别使用抗HA和抗FLAG免疫磁珠可以互相垂钓到NUP93或PB1蛋白。使用RNase A消化后,NUP93与PB1的互作依然存在。此外,在共转染的条件下,发现NUP93和PB1在细胞内共定位。本研究通过过表达NUP93检测其对流感病毒的复制影响。流式分析结果显示,NUP93能增强DF-1细胞中带GFP荧光标记的流感病毒复制;蛋白印迹和病毒增殖曲线结果显示,NUP93在细胞中增加JX/H5N6和DW/H5N1病毒NP蛋白表达量,从而促进病毒滴度增殖。因此,NUP93是IAV在细胞上增殖的正调控因子。3.NUP93增强流感病毒聚合酶活性并促进NP入核通过本实验室建立的流感病毒的聚合酶活性检测系统验证了NUP93对聚合酶活性的影响。结果显示,过表达NUP93能增强流感病毒聚合酶活性。为了进一步探究NUP93促进病毒增殖的机制,我们考察了NUP93对vRNP入核与出核的影响。结果显示,过表达NUP93后,感染JX病毒2h时能促进vRNP的入核过程。对相同处理的细胞进行蛋白质水平的检测也得到相似的结果。