论文部分内容阅读
姜黄素是一种天然的、无公害的以及具有抗氧化和抗菌等作用的活性物质,常用作抗生素替代物。首先,通过生长实验,考察姜黄素对生长中期草鱼(Ctenoph-aryngodon idella)生产性能、肠道生长发育、肠道消化吸收能力和氨基酸转运能力的影响及可能机制;第二,通过攻毒试验和体外试验,考察姜黄素对草鱼肠道抗氧化防御体系的影响,探索姜黄素对草鱼肠道细胞结构完整性的影响及机制;第三,通过攻毒试验和体外试验,考察姜黄素对草鱼肠道细胞顶端连接复合体和相关信号通路的影响,探索姜黄素对草鱼肠道细胞间结构完整性的影响及机制。主要研究内容和结果如下:1.姜黄素对生长中期草鱼生产性能和肠道消化吸收能力的影响及可能机制试验1选取540尾的健康草鱼(平均初重为211.07±0.69 g),随机分配6个处理,每个处理3个重复,每个重复30尾。各处理组分别饲喂含姜黄素为0(对照组)、120、240、360、480和600 mg kg-1的饲粮60天。本试验旨在研究姜黄素对生长中期草鱼的生产性能、肠道消化吸收和氨基酸转运能力的影响。结果如下:饲粮添加适宜水平的姜黄素显著增加生长中期草鱼体重、体长(BL)、增重百分比(PWG)、特定生长率(SGR)、采食量(FI)、饲料转化效率(FE)、肠体指数(ISI)、肠重(IW)、皱襞高度、肠道蛋白含量(IPC)、消化酶和刷状缘膜酶活力(P<0.05),促进草鱼生长并提高其消化吸收能力;同时,姜黄素显著影响草鱼肠道氨基酸转运能力,但对不同肠段不同氨基酸的转运调控存在差异:1)姜黄素提高生长中期草鱼前肠(PI)、中肠(MI)和后肠(DI)的中性游离氨基酸(Met、Trp、Thr、Ile、Leu、Gly、Ser、Tyr和Cys)含量与其上调中性和碱性氨基酸转运载体SLC7A7、SLC7A6和SLC6A14),中性氨基酸转运载体(SLC6A19、SLC7A8和SLC1A5)以及Pep T1的m RNA水平有关;2)姜黄素提高生长中期草鱼PI和MI(而不在DI)中性游离氨基酸(Tau、Pro、Val和Phe)含量与其上调中性氨基酸转运载体SLC6A6、SLC38A2、SLC7A5和Pep T1的m RNA水平有关;3)姜黄素提高生长中期草鱼PI、MI和DI碱性游离氨基酸(Lys和Arg)含量与其上调中性和碱性氨基酸转运载体(SLC7A7、SLC7A6和SLC6A14),碱性氨基酸转运载体(SLC7A1)和Pep T1的m RNA水平相关;4)姜黄素提高生长中期草鱼PI和MI(而不在DI)酸性游离氨基酸(Asp和Glu)含量与其上调酸性氨基酸转运载体(SLC1A2和SLC1A3)及Pep T1的m RNA水平有关;5)姜黄素上调草鱼肠道氨基酸转运载体和Pep T1的基因表达可能与其激活TOR信号通路有关。以上实验结果表明,姜黄素可能通过激活TOR信号通路,上调氨基酸和小肽转运载体在草鱼肠道中的基因表达,提高其氨基酸转运能力。根据PWG、FE和FI,确定生长中期草鱼饲粮中姜黄素的适宜添加量分别为312.27、314.17和311.77 mg kg-1。2.姜黄素对草鱼肠道细胞抗氧化防御体系的影响及可能机制试验2主要研究姜黄素对草鱼肠道细胞抗氧化防御体系的保护作用,分为三个小试验。生长试验(试验1)结束后,分别从每个处理随机选取24尾草鱼,分3个重复,每个重复8尾鱼,用浓度为2.5×10~8 CFU/m L(预试验确定)、体积为1.0 m L的嗜水气单胞杆菌(Aeromonas hydrophila)菌液注射于草鱼腹腔进行7天的攻毒试验(试验2.1)。本试验旨在研究姜黄素对草鱼肠道抗氧化防御体系的影响。结果如下,饲粮添加适宜水平的姜黄素抑制了由嗜水气单胞杆菌攻毒引起的生长中期草鱼肠道中MDA、PC和ROS含量得升高;姜黄素调节草鱼肠道抗氧化防御体系各因子存在差异:1)姜黄素提高了草鱼肠道中抗氧化酶ASA、AHR、SOD、Cu Zn SOD、Mn SOD、CAT、GPx、GST和GR的活性与T-AOC和GSH的含量,以及抗氧化酶基因GPx1a、GPx1b、GSTR、GSTp1、GSTp2、GSTo1、GSTo2、Cu Zn SOD、Mn SOD、Prxd3、Prxd5、Srx1、Glrx2、GR、CAT和信号分子PGC-1α与Nrf2的表达(P<0.05);2)姜黄素促进了PI和MI中GPx4b的基因表达而在DI中没有影响;3)姜黄素抑制了PI和MI中Keap1a的基因表达而在DI中没有影响;4)姜黄素抑制了PI中Keap1b的基因表达而在MI和DI中没有影响。试验2.1的研究结果表明姜黄素能够提高草鱼肠道的抗氧化防御体系功能。为进一步探索其作用方式,开展了两个体外试验(试验2.2和2.3)考察姜黄素对草鱼肠上皮细胞抗氧化防御体系的影响及其机制。试验2.2设计5个处理考察姜黄素是否通过激活PGC-1α信号通路调控草鱼原代肠上皮细胞抗氧化防御体系。5个处理分别为对照组(Control)、H2O2氧化应激模型组(H2O2)、H2O2氧化应激模型加姜黄素组(H2O2+Curcumin)、H2O2氧化应激模型加PGC-1α抑制剂(SR-18292)组(H2O2+SR-18292)和H2O2氧化应激模型加PGC-1α抑制剂加姜黄素组(H2O2+SR-18292+Curcumin),每个处理6个重复。结果如下:1)姜黄素显著抑制草鱼肠上皮细胞中由氧化应激引起的MDA和PC含量增加,提高其抗氧化损伤能力(P<0.05);2)姜黄素显著提高抗氧化酶SOD、Cu Zn SOD、Mn SOD、CAT、GPx、GST和GR的活性及GSH的含量,上调抗氧化酶基因Srxn1、Glrx2、Prdx3、Prdx5和Mn SOD的m RNA水平(P<0.05);3)抑制PGC-1α信号通路不会影响姜黄素对Nrf2信号通路的作用。因此,设计试验2.3进一步探讨了姜黄素是否通过激活Nrf2信号通路调控草鱼原代肠上皮细胞抗氧化防御体系。试验2.3设计5个处理,分别为对照组(Control)、H2O2氧化应激模型组(H2O2)、H2O2氧化应激模型加姜黄素组(H2O2+Curcumin)、H2O2氧化应激模型加Nrf2抑制剂(Luteolin)组(H2O2+Luteolin)和H2O2氧化应激模型加Nrf2抑制剂加姜黄素组(H2O2+Luteolin+Curcumin),每个处理6个重复。结果如下:1)姜黄素通过激活Nrf2信号通路提高草鱼肠道上皮细胞中抗氧化酶SOD、Cu Zn SOD、Mn SOD、CAT、GPx、GST和GR的活性及GSH的含量,上调抗氧化酶基因Srxn1、Glrx2、Prdx3、Prdx5和Mn SOD的m RNA水平;2)抑制Nrf2信号通路不会影响姜黄素对PGC-1α信号通路的作用。试验2结果表明,姜黄素可同时激活PGC-1α和Nrf2信号通路保护草鱼肠道细胞抗氧化防御体系功能。3.姜黄素对草鱼肠道细胞间结构完整性的影响及可能机制试验3旨在研究姜黄素对生长中期草鱼肠道顶端连接复合体的保护作用,分为两个小试验。试验3.1在攻毒试验的基础上,考察姜黄素对草鱼肠道顶端连接复合体结构的影响。结果发现,饲粮添加适宜水平的姜黄素能保护生长中期草鱼肠道顶端连接复合体结构的功能:1)姜黄素促进了生长中期草鱼肠道中ZO-1、β-catenin、E-cadherin和afadin的基因和蛋白表达,以及ZO-2、claudin-b、claudin-c、claudin-f、claudin-3c、claudin-11和α-catenin的基因表达,抑制了其相关信号通路NMⅡ和MLCK的基因表达;2)姜黄素抑制了草鱼肠道中claudin-15a的基因表达;3)姜黄素上调了草鱼PI、MI和DI中occludin的基因表达并提高其在PI和MI的蛋白表达,但对DI中occludin蛋白表达没有影响;4)姜黄素促进了草鱼PI和MI中JAM-A的基因表达而在DI中没有影响;5)姜黄素促进了草鱼PI和MI中claudin-7a和claudin-7b的基因表达而在DI中没有影响;6)姜黄素抑制了草鱼PI和MI中claudin-12和claudin-15b的基因表达而在DI中没有影响;7)姜黄素促进了草鱼PI和MI中nectin的基因和蛋白表达而在DI中没有影响;8)姜黄素抑制了草鱼PI和MI中Rh OA和ROCK的基因表达与Rh OA的蛋白表达而在DI中没有影响。试验3.1的结果表明姜黄素能够保护攻毒后生长中期草鱼的顶端连接复合体结构。为进一步探索其作用方式,设计了体外试验3.2,试验设计4个处理,分别为对照组(Control)、H2O2氧化应激模型组(H2O2)、姜黄素组(Curcumin)和H2O2氧化应激模型加姜黄素组(H2O2+Curcumin),每个处理6个重复。考察姜黄素是否通过抑制Rh OA、ROCK、NMⅡ和MLCK信号通路保护草鱼原代肠上皮细胞顶端连接复合体结构。结果如下:1)氧化应激能够激活草鱼肠上皮细胞Rh OA、ROCK、NMⅡ和MLCK信号通路;2)姜黄素能够通过抑制Rh OA、ROCK、NMⅡ和MLCK信号通路提高紧密连接相关分子ZO-1、occludin和claudin-3c的基因表达以及粘附连接相关分子β-catenin、E-cadherin、afadin和nectin的基因表达。结果表明,姜黄素通过抑制Rh OA、ROCK、NMⅡ和MLCK信号通路保护草鱼肠道细胞的顶端连接复合体。综上所述,饲粮添加适宜水平的姜黄素能促进草鱼的生长,这可能与其通过激活TOR信号途径上调肠道氨基酸转运载体和Pep T1的基因表达,从而提高肠道氨基酸转运能力,进而提高其消化吸收能力有关。消化吸收能力与肠道结构完整有密切的关系,进一步研究发现,姜黄素一方面通过同时激活草鱼肠道PGC-1α和Nrf2信号途径提高草鱼肠道抗氧化损伤能力,维持肠道细胞结构完整性;另一方面通过抑制其Rh OA、ROCK、NMⅡ和MLCK信号通路调控肠道顶端连接复合体的基因和蛋白表达,维持细胞间结构完整性,从而保护草鱼肠道的物理屏障。