小桐子树为我国广泛种植的生物能源树种。小桐子种仁榨油后的饼粕富含蛋白质,是一种潜在的植物蛋白饲料资源,但其中的生物毒性物质限制了其在动物饲料中的应用。微生物固态发酵法被认为是降解生物毒素的有效方法。迄今为止,小桐子饼及其固态发酵产品在动物生产尤其是猪生产中的应用研究还很少,对动物健康影响的机理也尚不明确。本研究通过改进小桐子饼毒性评价标准,筛选出高效脱毒菌株进行优势组合来开发新型混菌固态发酵小桐子饼饲料;并以生长猪为试验对象,从肠道微生物组学和代谢组学层面研究了小桐子饼和发酵小桐子饼对其生长和健康的作用机理。研究一方面旨在通过促进小桐子饼资源的深度开发来缓解蛋白质饲料短缺的严峻现状,同时也有助于理解有毒待开发饲料资源、固态发酵饲料及其代谢产物与饲料安全和营养之间的关系,为新型饲料资源的开发和发酵饲料的科学利用提供新的视角。试验一小桐子饼对生长猪的生产性能和健康的影响及机理本试验考察饲粮中添加小桐子饼对猪生长性能、器官组织形态、表观养分消化率、机体氧化还原状态、免疫应激参数、炎性细胞因子、结肠微生物区系和代谢产物的影响,探讨其作为新型蛋白质饲料的可能性。试验采用单因子试验设计,选取日龄相近,体重为25.21±1.34 kg的DLY生长猪32头,均分为2个处理组,分别饲喂玉米豆粕型饲粮和5%小桐子饼添加型饲粮,试验期为28 d。结果如下:1)小桐子饼饲粮组呈现精神抑郁、消瘦、少食、声音嘶哑、后肢无力、腹泻等症状。组织形态学观察发现肠、下丘脑、肝脏和肾脏组织均产生病变,具体表现为:肠绒毛萎缩;下丘脑神经元细胞出现核固缩,周围有炎性细胞浸润;肝细胞增大、胞浆疏松、细胞内可见粉红色嗜酸性颗粒;肾小球毛细血管丛周围可见红细胞、中性粒细胞和纤维样渗出物。2)小桐子饼组猪的末重、平均日增重和平均日采食量显著降低（P＜0.05）。小桐子饼组猪对干物质、能量、粗蛋白、粗灰分和粗脂肪的表观消化率显著降低（P＜0.05）;血浆中天冬氨酸转氨酶和碱性磷酸酶的活性,尿素氮、总蛋白和白蛋白的含量显著升高（P＜0.05）,葡萄糖、免疫球蛋白Ig G和Ig M的浓度显著降低（P＜0.05）,而皮质醇含量显著上升（P＜0.05）。小桐子饼饲粮降低了猪肠黏膜、血浆和下丘脑中抗氧化酶的水平及总抗氧化能力（T-AOC）,提升了组织中脂质过氧化物MDA的含量（P＜0.05）。猪肠黏膜、血浆和下丘脑中炎性细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-1和IL-6）的含量也显著上升（P＜0.05）。3)小桐子饼饲粮降低了猪结肠中粪杆菌、小杆菌和氨基酸球菌的相对丰度,提升了p-75-a5、脱硫弧菌、月形单胞菌、草酸杆菌、L7A＿E11、rc4-4、施氏菌属和粪芽孢菌属的相对丰度（P＜0.05）。对结肠内容物的代谢组学分析表明,小桐子饼饲粮组与对照组存在显著差异的代谢产物有114种,其中显著降低的代谢产物包括次级胆汁酸、维生素B族、左旋肉碱、乙酰肉碱、甜菜碱、褪黑素、4-氨基丁酸等;显著增加的代谢产物主要包括组胺、N-乙酰尸胺、N-乙酰基腐胺、氧喹啉、初级胆汁酸。2组动物的结肠差异代谢物KEGG通路富集分析表明,饲喂小桐子饼引起了ABC转运体、精氨酸和脯氨酸代谢、蛋白质消化和吸收、神经活性配体-受体相互作用、精氨酸生物合成、癌症的中心碳代谢、GABAergic突触等通路的显著变化。4)将差异微生物与代谢产物、生产性能和生理生化指标进行关联分析发现,小桐子饼组猪结肠中富集的微生物p-75-a5、L7A＿E11、草酸杆菌、月形单胞菌、rc4-4、脱硫弧菌和施氏菌属多与皮质醇、炎性因子（IL-1、IL-6和IFN-γ）、组胺、初级胆汁酸以及碳水化合物代谢中间产物（D-甘露糖和DL-乳酸）的水平呈正相关,而与ADFI、ADG、维生素B族、4-氨基丁酸、褪黑素、甜菜碱、左旋肉碱和次级胆汁酸的水平呈负相关。结果表明,对生长猪饲喂含5%小桐子饼的饲粮显著降低了其生产性能,并引起了肠道、肝、肾和下丘脑的组织损伤。这可能与小桐子饼中的毒素诱导的有益微生物的丰度下降和促炎性微生物的丰度增加有关,从而进一步促进了后肠炎症和毒性相关代谢产物的上升,最终导致猪的系统性毒性反应。猪对小桐子饼毒素的敏感度凸显了对其脱毒处理后再饲用的必要性。试验二构建斑马鱼生存率模型筛选脱毒菌株、优化发酵参数及对发酵产品的评定本试验首先构建了小桐子饼毒素对斑马鱼的致死率模型来筛选高效脱毒菌株,随后对发酵过程的关键参数进行了逐层优化,并测定了饼粕发酵前后的概略养分、毒素含量、表观形态和代谢产物的变化。结果如下:1)小桐子饼毒素对斑马鱼的LC99浓度值为43.945 mg/L;以此为阈值标准,筛选出3株高效脱毒菌株,分别鉴定并命名为:巨大芽孢杆菌SCYA10、白地霉SCYA23和卷枝毛霉SCYA25。经单因素和响应面法建立了菌种间配比、总接种量、麸皮添加量、初始加水量、发酵温度和发酵时间对毒素综合降解率的优化模型,模型极显著（P＜0.001）,拟合度良好。优化后的各发酵参数如下,菌液浓度为1×10~7孢子/m L,巨大芽孢杆菌SCYA10:白地霉SCYA23:卷枝毛霉SCYA25=2:3:1,接种量15.25%（v/w）,料水比1:0.68（w/v）,发酵温度30.3℃,发酵时间21.37 d。在上述条件下发酵小桐子饼的综合脱毒率达96%。2)发酵后小桐子饼的粗蛋白含量提高了8.37%,粗脂肪和粗纤维分别降低了45.62%和25.83%;关键毒素如佛波酯、胰蛋白酶抑制剂、植物凝集素,皂苷和总酚的降解率分别为76.34%、89.20%、64.06%、84.75%和62.5%;扫描电镜结果表明,发酵过程增加了饼粕表面结构的疏松度,可能有利于提高动物对原料的消化利用率。3)发酵前后的小桐子饼存在448种差异物质,其中在发酵小桐子饼中上升的物质主要包括肉碱类、4-氨基丁酸和5-羟色胺受体调节剂类、香味剂和乳化剂、驱虫剂类、小肽类。下调的物质主要包括碳水化合物、脂类、神经毒性物质、皂甙等。差异代谢物的KEGG通路富集分析表明,发酵前后小桐子饼在ABC转运体、精氨酸生物合成、氨-酰t RNA合成、亚油酸代谢、次级代谢物合成、神经活性配体-受体相互作用、癌症的中心碳代谢、GABAergic突触等通路发生了显著变化。结果表明,以斑马鱼生存率模型筛选得到的优势组合菌群——巨大芽孢杆菌SCYA10、白地霉SCYA23和卷枝毛霉SCYA25实现了对小桐子饼的高效脱毒。发酵过程对蛋白质代谢、氨基酸生物合成、神经活性配体-受体相互作用和GABAergic突触等重要通路均产生了显著影响,表现为发酵过程增加了小肽、氨基酸、肉碱、神经递质受体调节剂、乳化剂、芳香类物质和杀虫类化合物的含量,降低了碳水化合物、脂类和氧化应激、神经毒性物质的含量,这些代谢产物种类和数量的差异表明发酵过程对小桐子饼饲用价值的有效提升。发酵产品在动物饲料中的适用性有待开展下一步的生产试验来进行验证。试验三发酵小桐子饼对生长猪的生产性能、结肠微生物和代谢产物的影响及其对菌肠脑轴的调控作用采用单因子试验设计,选取日龄相近,体重为27.60±1.59 kg的生长猪64头,随机分到4个处理组中。发酵小桐子饼在各组的添加量分别为0%、2.5%、5%和7.5%,试验期为28 d。结果如下:1)5%发酵小桐子饼添加组的平均日增重显著提高（P＜0.05）,各发酵小桐子饼添加组的料重比较对照组有提高的趋势（P=0.071）;5%和7.5%发酵小桐子饼添加组的总能、粗蛋白、钙和磷的表观消化率高于对照组（P＜0.05）;7.5%发酵小桐子饼添加组的粗灰分表观消化率显著高于高于对照组（P＜0.05）。2)饲喂发酵小桐子饼对猪的肠、肝、肾和下丘脑组织形态均无可见毒性作用。肠道发育分析表明,5%和7.5%发酵小桐子饼添加组猪的十二指肠和空肠绒毛高度,空肠绒隐比显著高于0%和2.5%组（P＜0.05）。5%发酵小桐子饼添加组的回肠绒毛高度显著高于其他各组（P＜0.05）。饲喂5%和7.5%发酵小桐子饼显著降低了生长猪的结肠p H值（P＜0.05）,5%发酵小桐子饼组猪结肠中丁酸和总短链脂肪酸的含量显著增加（P＜0.05）。饲喂发酵小桐子饼对血浆免疫球蛋白Ig G、Ig A和Ig M的含量无显著影响,对皮质醇的水平也无显著影响（P＞0.05）。在空肠中,5%发酵小桐子饼组CAT含量最高,而MDA含量最低（P＜0.05）。结肠中,各发酵小桐子饼饲喂组的GSH-Px、T-AOC和T-SOD水平较基础饲粮组升高,MDA含量较基础饲粮组降低,而CAT的水平在各组间无显著差异（P＞0.05）。在血浆中,饲喂发酵桐子饼有提高T-AOC的趋势（P=0.062）。在下丘脑中,5%和7.5%发酵小桐子饼组的T-SOD水平最高（P＜0.05）,添加发酵小桐子饼均降低了下丘脑中MDA（P＜0.05）的水平。对炎性细胞因子含量的分析表明,饲喂5%和7.5%发酵小桐子饼组猪的结肠中IL-1和IL-6的含量显著降低（P＜0.05）;5%发酵小桐子饼下丘脑中IL-1的水平和血浆中TNF-α、IL-6的含量显著降低（P＜0.05）。3)鉴于上述结果表明5%发酵小桐子饼饲粮对猪的生产性能和健康状况具有优于基础饲粮组的效果,试验进一步比对了这2个处理组在结肠微生物和代谢产物层面的差异;并依据代谢组学测定结果,选取代表性差异代谢产物进行后续延伸分析,以探究5%发酵小桐子饼对猪生产性能和健康状况改善的可能影响方式和机理。结肠微生物组学分析表明,对照组和5%发酵小桐子饼组猪结肠微生物的alpha多样性无显著差异（P＞0.05）,但饲喂5%发酵小桐子饼提升了普雷沃氏菌属和链球菌属的丰度,降低了p-75-a5、厌氧弧菌属、脱硫弧菌属、甲烷短杆菌属、光冈菌属、施氏菌属和夏普氏菌属的丰度。4)结肠内容物的代谢组学分析表明,5%发酵小桐子饼饲粮组与对照组存在差异显著的代谢产物有47种。饲喂5%发酵小桐子饼组显著增加的代谢产物主要包括维生素类、肉碱类、神经递质类、短链脂肪酸、次级胆汁酸。显著降低的代谢产物主要包括初级胆汁酸、脂类及衍生物、吲哚、小肽、嘧啶类。差异代谢物的KEGG通路富集分析表明,2组代谢产物在GABAergic突触、维生素B6代谢、突触囊泡循环、精氨酸和脯氨酸的代谢、鞘脂类代谢、鞘脂信号通路、逆行神经信号、神经活性配体-受体相互作用、胆汁分泌、精氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、环磷酸腺苷信号通路、嘧啶代谢、细胞凋亡、味觉转导、氨基酸的生物合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等通路均发生了显著变化。5)微生物与生理生化指标的关联分析表明,饲喂5%发酵小桐子饼组结肠中富集的普雷沃氏菌属与MDA呈负相关,与T-SOD呈正相关;富集的链球菌属与结肠中的MDA和IL-6呈负相关,与T-SOD呈正相关。微生物和结肠代谢产物的关联结果表明,饲喂5%发酵小桐子饼组结肠中富集的普雷沃氏菌属和链球菌属与胆酸、胆固醇硫酸盐、鞘氨醇和鞘氨酸的含量呈负相关,与左旋肉碱、石胆酸、维生素B6、4-氨基丁酸和5-羟色胺的含量呈正相关。6)饲喂5%发酵小桐子饼组猪的血浆中5-羟色胺和4-氨基丁酸的浓度显著上升（P＜0.05）,多巴胺浓度无显著变化（P＜0.05）;下丘脑中5-羟色胺、4-氨基丁酸和多巴胺的浓度均显著提升（P＜0.05）。与各神经递质对应的前体芳香氨基酸水平在5%发酵小桐子饼组猪的血浆和下丘脑中均显著上升（P＜0.05）。7)饲喂5%的发酵小桐子饼提升了猪下丘脑中Ah R、Nrf2、SOD和GPx的基因表达水平（P＜0.05）,降低了Keap1基因的表达（P＜0.05）。5%发酵小桐子饼同时也提升了猪结肠中Ah R、Nrf2、SOD、GPx和NQO1的基因表达水平（P＜0.05）,降低了Keap1基因的表达（P＜0.05）。结果表明,饲喂7.5%的发酵小桐子饼饲粮对猪的生产性能和健康状况无不良影响。饲喂5%的发酵小桐子饼饲粮对猪的生产性能、养分表观消化率、肠道发育、抗氧化抗炎症水平和肠道微观环境诸方面有优于基础饲粮的效果,原因在于发酵小桐子饼一方面促进了芳香氨基酸的循环利用,从而保障了神经递质的合成效率;另一方面饲喂发酵小桐子饼改变了猪结肠菌群组成,提升了5-羟色胺、4-氨基丁酸、短链脂肪酸和次级胆汁酸等有益代谢产物的水平,并激活了神经元功能基因Ah R的表达,进而提升了其下游抗氧化基因Nrf2等的表达,最终促进了猪生产性能和健康状况的改善。综上所述,饲喂小桐子饼破坏了猪后肠的微生物生态平衡并促进了炎症和毒性相关代谢产物的上升,从而引起了肠、肝、肾和下丘脑的组织损伤以及系统性的毒性反应。本研究通过构建斑马鱼生存率模型,优化了小桐子饼脱毒评价的标准;在此基础上筛选出的3株高效脱毒微生物及后续开发的混菌固态发酵工艺参数实现了对小桐子饼的高效脱毒和微营养的提升。发酵产品能以7.5%的添加比例饲喂生长猪,而5%的添加比例对猪的生产性能和健康水平有优于基础饲粮的效果,产生的有益效应与其对猪肠道微生物、微环境和菌肠脑轴的调控作用有关。