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研究显示,全世界包括中国的甲状腺癌（Thyroid Carcinoma,TC）发病率均呈增加态势。甲状腺乳头状癌（Papillary Thyroid Carcinoma,PTC）发病率的增长是甲状腺癌发病率的上升的主要原因。PTC属于相对惰性的肿瘤,其预后相对较好,术后20年生存率在90%以上,但其仍可对患者的生活造成影响,尤其是造成较为严重的、长期的经济与心理负担。并且,其中仍约有20%的患者肿瘤体积较大,预后较差,如发生淋巴结转移等。可见,在甲状腺癌发病率逐步增加的趋势下,对甲状腺癌最常见、多发的组织学类型即PTC开展研究工作具有重要的临床价值与社会价值。叉头框（Forkheadbox,FOX）蛋白转录因子家族是1990年被发现的,可在转录水平调控基因表达。研究显示,FOX蛋白家族成员FOXK1在肿瘤发生、发展中扮演了多种重要角色,包括促进肿瘤细胞增殖、转移,调控肿瘤血管生成,以及调控上皮细胞-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）进程等。然而FOXK1在PTC中扮演的角色及相关机制尚不明确。富半胱氨酸 61（Cysteine-rich 61,CYR61）,又名 CCN1（Cellular Communication Network Factor 1,CCN1）,是 CCN基因家族中的一员,研究显示,CYR61可以促进多种肿瘤恶性进展。有文献报道,CYR61可增强甲状腺未分化癌（Anaplastic Thyroid Cancer,ATC）细胞的迁移和侵袭能力,这提示CYR61在甲状腺癌的发生、发展中可能发挥着一定作用。然而CYR61在PTC中的作用及相关机制尚无报道。同时,一项关于结直肠癌的研究显示,CYR61是FOXK1的作用靶点,后者可调控CYR61的转录。也有文献显示,CYR61可以调控结缔组织生长因子（Connective Tissue Growth Factor,CTGF）的表达,而 CTGF 与肿瘤进展同样密切相关。然而尚无研究报道在PTC中FOXK1能否调控CYR61的转录,FOXK1、CYR61、CTGF的表达对PTC的增殖、迁移、侵袭等有何种影响。因此,本研究提出假设FOXK1可能具有促进PTC恶性进展的作用,且FOXK1的作用机制可能是通过调控CYR61、CTGF的表达从而促进PTC的恶性进展的。而当抑制FOXK1的表达时,可以抑制CYR61、CTGF的表达,最终抑制瘤体的生长。通过开展本研究可以明确FOXK1、CYR61、CTGF在PTC中的作用及相关机制,加深对FOXK1、CYR61、CTGF及PTC的认识,为PTC的靶向治疗提供理论支持。第一部分FOXK1在PTC细胞中的基本生物学功能目的探索FOXK1在PTC细胞中的基本生物学功能,明确其对PTC细胞增殖、迁移、侵袭的影响。方法1.qRT-PCR 和 Western Blot 检测 PTC 细胞系 TPC-1、KTC-1、SNU-790、K1与人正常甲状腺细胞HTori-3中FOXK1表达水平,然后比较表达水平的差异。2.通过构建pcDNA4.1-FOXK1载体转染PTC细胞过表达FOXK1,通过shRNA干扰技术敲低PTC细胞中FOXK1的表达,采用qRT-PCR及Western Blot验证过表达及沉默效率。过表达实验中,将FOXK1组记为FOXK1过表达组,Vector组记为对照组。敲低实验中,将shFOXK1#1、shFOXK1#2均记为敲低组,但敲低所用序列有所不同。Scramble组为敲低组的对照组。3.对过表达FOXK1及敲低FOXK1表达的PTC细胞开展实验,通过MTT法检测细胞活力,BrdU染色检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,transwell检测细胞侵袭能力。结果1.与人正常甲状腺细胞HTori-3相比,PTC细胞系TPC-1、KTC-1、SNU-790、K1中的FOXK1的表达水平均较高,且差异有统计学意义（p＜0.05）。PTC细胞系之间相比,TPC-1细胞中FOXK1的表达水平最高,SNU-790细胞中FOXK1的表达水平最低。因此选择这两个细胞系进行后续实验。2.选择SNU-790细胞进行FOXK1过表达实验,选择TPC-1细胞进行FOXK1敲低实验。qRT-PCR及Western Blot结果所示,过表达组FOXK1表达水平高于Vector组,两组间差异有统计学意义（p＜0.01）;敲低组FOXK1表达水平低于Scramble组,两组间差异有统计学意义（p＜0.05）。相比而言,shFOXK1#1组表达水平低于shFOXK1#2组,因此选择shFOXK1#1为FOXK1的敲低方案进行后续实验。3.MTT实验结果显示,过表达FOXK1组SNU-790的细胞活力显著高于Vector组（p＜0.01）,敲低FOXK1表达的shFOXK1#1组TPC-1的细胞活力显著低于Scramble组（p＜0.01）。BrdU染色结果显示,过表达FOXK1组SNU-790细胞的BrdU阳性率显著高于Vector组（p＜0.01）,shFOXK1#1组TPC-1细胞的BrdU阳性率显著低于Scramble组（p＜0.01）。细胞划痕实验结果显示,过表达FOXK1组SNU-790细胞划痕宽度显著小于Vector组（p＜0.01）,shFOXK1#1组TPC-1的细胞划痕宽度显著大于Scramble组（p＜0.001）。Transwell实验结果显示,过表达FOXK1的SNU-790细胞侵袭细胞数量显著多于Vector组（p＜0.01）,shFOXK1#1组TPC-1细胞侵袭细胞数量显著少于Scramble组（p＜0.01）。结论1.FOXK1的表达可以增强PTC细胞体外增殖、迁移、侵袭能力。第二部分FOXK1促进PTC细胞恶性表型的作用机制目的探索FOXK1的表达对CYR61、CTGF表达的影响,CYR61的表达对CTGF表达的影响,以及上述影响与PTC细胞增殖、迁移、侵袭能力的关系,明确FOXK1增强PTC细胞体外增殖、迁移、侵袭能力的分子生物学机制。方法1.选择SNU-790细胞进行FOXK1过表达实验,选择TPC-1细胞进行FOXK1敲低实验。采用qRT-PCR和Western Blot检测CYR61、CTGF表达水平,观察FOXK1表达水平对CYR61、CTGF表达的影响。过表达实验中,将FOXK1组记为FOXK1过表达组,Vector组记为对照组。敲低实验中,将shFOXK1#1为敲低组,Scramble组为敲低组的对照组。2.选择SNU-790细胞进行FOXK1过表达实验。开展双荧光素酶报告实验检测FOXK1与野生型（wt）CYR61启动子、突变型（mut）CYR61启动子之间的作用。3.选择SNU-790细胞进行CYR61过表达实验,选择TPC-1细胞进行CYR61敲低实验。采用qRT-PCR和Western Blot检测CYR61、CTGF的表达。CYR61组记为CYR61过表达组,Control组记为其对照组。shCYR61#1组、shCYR61#2组均为CYR61敲低组,shNC为其对照组。4.选择 SNU-790 细胞分别进行 FOXK1+shNC、FOXK1+shCYR61#2、Vector+shNC处理,其中FOXK1+shNC组表示过表达FOXK1但不对CYR61表达水平处理,FOXK1+shCYR61#2组表示过表达FOXK1的同时敲低CYR61的表达,Vector+shNC组表示对FOXK1及CYR61的表达水平均不做处理。采用qRT-PCR 和 Western Blot 检测 CTGF 的表达。5.选择 TPC-1 细胞分别进行 Scramble+Control、shFOXK1#1+Control、shFOXK1#1+CTGF。其中,shFOXK1#1+CTGF组表示敲低FOXK1的表达且过表达CTGF,shFOXK1#1+Control组表示只敲低FOXK1而不对CTGF的表达水平处理,Scramble+Control组表示对FOXK1及CTGF的表达水平均不做处理。选择 SNU-790 细胞分别进行 Vector+shNC、FOXK1+shNC、FOXK1+shCTGF 处理。其中FOXK1+shCTGF组表示过表达FOXK1且敲低CTGF的表达,FOXK1+shNC组表示过表达FOXK1但对CTGF表达水平不做处理,Vector+shNC组表示对FOXK1及CTGF的表达水平均不做处理。qRT-PCR和Western Blot检测相关基因表达。通过MTT法检测细胞活力,BrdU染色检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,transwell检测细胞侵袭能力。结果1.过表达 FOXK1 的 SNU-790 细胞中 CYR61 的 mRNA（p＜0.01）及蛋白（p＜0.001）表达水平均显著高于Vector组。shFOXK1#1组TPC-1细胞中的CYR61的mRNA（p0.01）及蛋白（p＜0.05）表达水平均显著低于Scramble组。过表达FOXK1的SNU-790细胞中CTGF的mRNA表达水平与Vector组无统计学意义（p＞0.05）,但其蛋白表达水平显著高于Vector组（p＜0.001）。shFOXK1#1组TPC-1细胞中的CYR61的mRNA表达水平与Scramble组无统计学意义（p＞0.05）,但其蛋白表达水平显著低于Scramble组（p＜0.01）。2.与Vector组相比,突变型CYR61组荧光素酶活性无统计学意义（p＞0.05）,SNU-790过表达FOXK1组与野生型CYR61组之间荧光素酶活性明显较高（p＜0.01）。3.qRT-PCR和Western Blot结果显示,与Control组相比,CYR61组的SNU-790细胞CYR61表达水平显著较高（p＜0.01）。与shNC组相比,shCYR61#1组（p＜0.01）、shCYR61#2 组（p＜0.001）的TPC-1 细胞 CYR61 表达水平均显著较低,相比而言,shCYR61#2组CYR61表达水平低于shCYR61#1组。以上说明CYR61的过表达及沉默效率符合预期。选择敲低组中的shCYR61#2组进行后续实验。同时,qRT-PCR和Western Blot结果还显示,CYR61组中CTGF的蛋白表达水平显著高于Control组（p＜0.01）,shCYR61#1组（p＜0.05）、shCYR61#2组（p＜0.01）中CTGF的蛋白表达水平显著低于shNC组。4.FOXK1+shNC组CTGF的蛋白表达水平显著高于Vector+shNC组（p＜0.001）、FOXK1+shCYR61#2 组（p＜0.001）。5.经Western Blot检测,shFOXK1#1+Control组CTGF的蛋白表达水平显著小于 Scramble+Control 组（p＜0.001）及 shFOXK1#1+CTGF 组（p＜0.001）。MTT实验结果显示,shFOXK1#1+Control组TPC-1的细胞活力显著小于Scramble+Control 组（p＜0.01）及 shFOXK1#1+CTGF组（p＜0.01）;FOXK1+shNC组SNU-790 的细胞活力显著高于 Vector+shNC 组（p＜0.05）及 FOXK1+shCTGF组（p＜0.01）。BrdU 染色结果显示,shFOXK1#1+Control 组 TPC-1 的 BrdU 阳性率显著小于 Scramble+Control 组（p＜0.01）及 shFOXK1#1+CTGF 组（p＜0.001）。细胞划痕实验结果显示,shFOXK1#1+Control组TPC-1的划痕宽度显著大于Scramble+Control 组（p＜0.01）及 shFOXK1#1+CTGF 组（p＜0.01）。Transwell实验结果显示,shFOXK1#1+Control组TPC-1的侵袭细胞数量显著少于Scramble+Control 组（p＜0.01）及 shFOXK1#1+CTGF 组（p＜0.01）;FOXK1+shNC组SNU-790的侵袭细胞数量显著高于Vector+shNC组（p＜0.01）及FOXK1+shCTGF 组（p＜0.01）结论1.FOXK1的表达可以促进CYR61在mRNA和蛋白水平的表达。FOXK1的表达水平对CTGF的mRNA表达水平无影响,而对CTGF在蛋白水平的表达起到了促进作用。2.FOXK1可以与CYR61启动子结合并具有位点依赖性。3.CYR61的表达可以促进CTGF蛋白的表达。4.FOXK1对CTGF表达的调控作用是通过调控CYR61实现的。5.CTGF的表达可以增强PTC细胞体外增殖、迁移、侵袭能力。6.FOXK1与CYR61启动子结合促进后者表达,CYR61可促进CTGF的表达。FOXK1促进PTC细胞的增殖、迁移、侵袭是通过上调CTGF实现的。第三部分生物信息学及体内实验初步验证FOXK1的作用及机制目的生物信息学分析FOXK1、CYR61、CTGF三者表达水平之间的相关性,三者各自表达水平对总生存期的影响;观察抑制FOXK1的表达对瘤体生长及相关指标的影响。方法1.使用生物信息学工具TIMER2.0分析FOXK1在不同肿瘤中的表达情况,使用GEPIA分析FOXK1、CYR61、CTGF的表达情况对甲状腺癌总生存期的影响,以及FOXK1、CYR61、CTGF表达水平之间的关系。2.shFOXK1#1组及Scramble组TPC-1细胞注射于BALB/C裸鼠,开展成瘤实验。测量瘤体大小及重量。3.采集瘤体组织,免疫组化染色检测FOXK1、Ki-67、CYR61、CTGF,Western Blot检测E-钙粘蛋白及N-钙粘蛋白。结果1.与正常组织对比,FOXK1在包含甲状腺癌在内的多种肿瘤中显著高表达（p＜0.05）。FOXK1、CYR61、CTGF表达水平较高时,总生存期则较短（p＜0.05）。FOXK1、CYR61、CTGF三者之间的表达水平总体有呈正相关的趋势。2.shFOXK1组瘤体体积及重量均小于Scramble组,且差异性有统计学意义（p＜0.01）。3.shFOXK1组FOXK1、CYR61、CTGF、Ki-67、N-钙粘蛋白的表达均低于Scramble组,E-钙粘蛋白高于Scramble组。结论1.生物信息学分析所得结果与第一、第二部分所得的FOXK1的作用及其机制结论有一定一致性。2.降低FOXK1的表达水平可以下调CYR61、CTGF表达,明显抑制瘤体生长,并改善Ki-67及E-钙粘蛋白等指标。