二倍体泥鳅与大鳞副泥鳅自交、回交试验及其杂交F1代配子细胞学研究

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二倍体泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)和大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)属于鳅科(Cobitidae)、花鳅亚科(Cobitinae)中的泥鳅属(Misgurnus)和副泥鳅属(Paramisgurnus)。我国境内分布有天然的二倍体泥鳅(2n=50)和大鳞副泥鳅(2n=48)。二倍体泥鳅和大鳞副泥鳅正反杂交皆能产生子代(2n=49),但无论精巢还是卵巢都表现出明显的滞后发育。为探究二倍体泥鳅与大鳞副泥鳅杂交F1代的育性,本论文利用二倍体(DD)及大鳞副泥鳅(PP)及其杂交F1代(PD与DP)进行自交与回交,设计了10个交配组合,分别为(♀×♂):DD×DD、PP×PP、PD×DD、PD×PP、DP×DD、DP×PP、DD×DP、PP×DP、DD×PD、PP×PD。并从细胞学角度对二倍体泥鳅(M.anguillicaudatus)和大鳞副泥鳅(P.dabryanus)杂交F1代配子进行分析,主要研究内容如下。1.二倍体泥鳅和大鳞副泥鳅自交及回交受精率、孵化率、畸形率、早期成活率及子代生长差异比较。二倍体泥鳅和大鳞副泥鳅自交以及杂交的受精卵可正常发育,以杂交泥鳅为母本进行回交受精卵可正常发育,以杂交泥鳅为父本进行自交和回交未见正常受精现象,胚胎不可正常发育。数据分析结果表明:受精率PP×PP>DD×DD>DP×PP>PD×PP>DP×DD>PD×DD。其中二倍体泥鳅自交组合DD×DD(70.92±2.22%)与大鳞副泥鳅自交组合PP×PP(83.06±1.97%)的受精率显著高于其他各回交组的受精率(P<0.05)。回交组合中,以大鳞副泥鳅为父本提供精子的回交组合受精率显著高于以二倍体泥鳅为父本提供精子的回交组合的受精率。相对孵化率PP×PP>DD×DD>DP×PP>PD×DD>PD×PP>DP×DD。其中,相对孵化率相差不大,相对孵化率最高是PP×PP(91.17±0.39%)。统计学上相对畸形率DP×DD>PD×PP>PD×DD>DP×PP>PP×PP>DD×DD,其中两种自交组合的相对畸形率显著低于四种回交组合。相对7天存活率PP×PP>DD×DD>DP×PP>PD×DD>PD×PP>DP×DD,其中两种自交组合的相对7天存活率显著高于四种回交组合。在短期和长期生长实验中,1月龄,自交组合PP×PP平均体长显著高于其他组合(P<0.05);PD×DD的平均体长最短。4月龄,各类型的生长与短期生长试验相比存在差异。生长性能最好的PD×PP组平均体长为84.6mm、平均体重为7.24 g,生长性能最差的DD总长度为70.86 mm、体重为4.85 g。以大鳞副泥鳅为父系的PD×PP、PP×PP和DP×PP组的体长体重显著优于以二倍体泥鳅为母系的DP×DD、PD×DD和DD×DD组(P<0.05)。2.二倍体泥鳅与大鳞副泥鳅及其杂交F1代自交及回交胚胎发育对六种组合PP×PD、DD×PD、PD×PP、PD×DD、PP×PP、DD×DD的受精卵进行观察发现:其中PP×PD、DD×PD未见受精现象,胚胎发育表现出明显的未受精卵特征。PD×PP、PD×DD、PP×PP、DD×DD的受精卵胚胎发育正常。胚胎发育过程基本相似,都经过了2细胞器、4细胞期、8细胞期、16细胞期、32细胞期、64细胞期、多细胞期、高囊胚期、低囊胚期、原肠早期、原肠中期、原肠晚期、神经胚期、胚孔闭合期、肌节生成期、眼囊生成期、尾芽期、尾鳍出现期、眼晶体期、肌肉效应期、心脏跳动期、出膜期。在水温为25±0.5℃的时候,DD×DD从受精到出膜时间为34h48min,PP×PP从受精到出膜时间为35h40min,PD×PP从受精到出膜时间为36h16min,PD×DD从受精到出膜时间为34h46min。PD×PP,PD×DD两种回交组合胚胎发育时间略长于DD和PP两种自交组合,但总得来说,四种组合的完整的胚胎发育时间相差不大。3.二倍体泥鳅与大鳞副泥鳅杂交F1代回交子代核型分析利用细胞培养法对二倍体泥鳅与大鳞副泥鳅杂交F1代回交子代核型分析,发现无论是以PD或者DP为母本,当以二倍体泥鳅DD为父本时,回交子代细胞染色体数目众数皆为49条,以大鳞副泥鳅为父本时,回交子代染色体数目众数皆为48。核型公式为:DP×DD:2N=49,10m+6sm+33t,NF=65;PD×DD:2N=49,11m+4sm+34t,NF=62;DP×PP:2N=48,11m+6sm+31t,NF=65;PD×PP:2N=48,12m+4sm+32t,NF=64。通过比较分析,可以推断(1)正反交杂交泥鳅DD×PP和PP×DD产生的可育卵含有24条染色体,染色体组成不同(分别为5m+4sm+15t和6m+2sm+16t)。(2)在杂交泥鳅形成配子过程中很可能发生了罗伯逊易位。4.二倍体泥鳅与大鳞副泥鳅杂交F1代精子活力、形态及结构分析为了初步探究二倍体泥鳅和大鳞副泥鳅杂交F1代雄性不育的原因,本文通过计算机辅助精子活力分析系统(CASA)、光学显微镜、扫描电镜、透射电镜、流式细胞技术对二倍体泥鳅(DD)、大鳞副泥鳅(PP)、其正反杂交F1代(DP)和(PD)四种泥鳅精子的形态结构与活力进行了分析。结果显示,激活30 s时,DD和PP的精子运动率分别为76.50±0.70%和75.17±8.60%,极显著高于DP(3.65±1.75%)和PD(2.68±0.63%)(P<0.01),且杂交泥鳅的其它相关运动参数也极显著低于DD和PP(P<0.01),应用流式细胞技术对四种泥鳅精巢内细胞进行倍性鉴定,发现DD和PP精巢内大多为1N精子,而DP和PD精巢内除了正常单倍体精子外,还有大量的2N和4N以及少量的8N细胞。通过扫描电镜和透射电镜发现,DD与PP精巢内精子细胞致密,细胞结构完整,大小均匀,其全长分别为(33.71±2.12)和(34.28±1.83)μm。而DP和PD精巢内出现了大量的异常精子,如多尾精子、双核精子以及大头精子,其头部大小表现出明显的多态性,根据头部体积大小测量估算其倍性,其中有正常的精子即单倍体精子,同时有二倍体精子、四倍体精子、八倍体精子甚至更高倍性的精子。这些杂交泥鳅的异常精子为其精子活力低下以及雄性不育提供了重要证据。
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