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目的:⑴利用新生大鼠皮层原代培养的星形胶质细胞构建氧糖剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/recovery,OGD/R)诱导的离体胶质疤痕模型,在此模型上分析肌肽对反应性星形胶质细胞增殖和迁移的作用及其相关的作用机制。⑵在神经元/星形胶质细胞的共培养体系中,观察肌肽对氧糖剥夺/再灌注诱导的神经元死亡及神经元突起生长的作用。 方法:①利用乳酸脱氢酶检测试剂盒和5-溴脱氧尿核苷(5-Bromodeoxyuridine,BrdU)免疫荧光染色法观察缺糖缺氧及再灌注不同时间点星形胶质细胞的增殖情况,同时利用免疫荧光染色和western blot技术检测胶质原纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)的表达水平变化,以确定合适的诱导显著反应性胶质增生的OGD/R时间。②在OGD结束后,再灌注的同时加入不同浓度的肌肽(1 mM、5mM),并使用细胞内乳酸脱氢酶总含量检测法和BrdU标记法,分析肌肽在OGD/R诱导的反应性胶质增生中的作用及其最佳的作用浓度。③通过流式细胞仪检测5mM肌肽处理对OGD/R后星形胶质细胞的细胞周期的作用,并进一步利用western blot技术,检测其相关的作用机制。④通过海马生物能量代谢检测仪实时监测细胞氧耗率(OCR)与胞外酸化率(ECAR),获得一系列与氧化磷酸化及糖酵解相关的指标,从而研究OGD2 h/R24 h条件下5mM肌肽处理对星形胶质细胞的能量代谢是否具有调节作用。⑤使用Transwell迁移实验,检测5 mM肌肽处理对OGD/R后星形胶质细胞的迁移作用有无影响。并进一步利用western blot技术,检测其相关的作用机制。⑥利用Hoechst33342和PI核荧光双染法,观察5 mM肌肽处理对共培养体系OGD/R诱导的神经元存活率的影响。⑦通过β-Ⅲ Tubulin免疫荧光染色法,分析5 mM肌肽处理对OGD/R后神经元突起生长有无作用。 结果:⑴缺糖缺氧2h再灌注24 h可以诱导显著的反应性星形胶质细胞增生,最终确定OGD2 h/R24 h作为后续实验条件。⑵缺糖缺氧后再灌注的同时加入5mM肌肽处理可以抑制OGD2 h/R24 h诱导的星形胶质细胞增殖。⑶5mM肌肽处理后可以抑制OGD/R后星形胶质细胞G1期到S期的转变,该作用可能与肌肽对cyclinD1的调控作用相关。⑷OGD/R后,星形胶质细胞的能量代谢水平较正常组显著上调,5mM肌肽处理对OGD/R后上调的能量代谢水平有一定的下调作用。⑸OGD/R后星形胶质细胞的迁移能力明显增加,同时OGD/R过程中肌肽的处理与未处理组相比,可以降低星形胶质细胞的迁移能力;且该作用可能与肌肽对MMP9的调控作用相关。⑹在星形胶质细胞和神经元细胞的共培养体系中,5mM肌肽处理可以减少OGD/R诱导的神经元死亡。⑺在星形胶质细胞和神经元细胞的共培养体系中,OGD/R后神经突起的长度较对照组显著减少,而肌肽处理可促进OGD/R后的神经元突起的生长。 结论:①缺糖缺氧2h/再灌注24h诱导体外胶质疤痕模型构建成功。②肌肽抑制OGD/R诱导的反应性星形胶质细胞增生可能是通过调控细胞周期及能量代谢实现的。③肌肽处理可以降低OGD/R后星形胶质细胞的迁移能力。④在神经元/星形胶质细胞的共培养体系中,肌肽处理对OGD/R过程中损伤的神经元具有保护作用。