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研究目的:本课题组在前期研究中构建DMN大鼠肝纤维化模型，通过miRNA表达谱芯片检测，发现： miR-34c可能在肝纤维化进程中发挥重要作用，且靶基因预测系统推测，ACSL1可能是miR-34c的作用靶点。因之，本实验：将通过萤光素酶报告系统进一步验证ACSL1是否为miR-34c的作用靶点；检测miR-34c和ACSL1在不同状态肝星状细胞（Hepatic Stellate Cell，HSC）中的表达水平；同时在活化态HSC中下调miR-34c的基因表达水平，研究miR-34c调控靶基因ACSL1对HSC活化的影响作用。研究方法：第一部分：大鼠原代HSC的提取与鉴定1、采用Friedman酶消化-密度梯度离心法：（1）对雄性SD大鼠行麻醉后，分离门静脉进行插管，依次灌注D-Hank’s液、链酶蛋白酶消化液和胶原酶消化液；（2）将肝脏充分消化后过滤，离心，用Nycodenz和DNase I液调整细胞悬液的密度，使密度达到1.040-1.055g/ml之间，铺上无Ga的Gass液，提取星状细胞；（3）细胞计数后，按比例接种于细胞皿中，放入CO2细胞培养箱中培养传代。2、在328nm紫外光的激发下显微镜观察HSC。3、细胞免疫荧光法检测培养2天、14天HSC中Desmin和α-SMA的表达。第二部分：miR-34c与ACSL1的靶向关系检测及其在不同状态HSC中表达水平的检测1、在课题组前期工作的基础上，利用萤光素酶靶向报告系统验证miR-34c和ACSL1是否存在靶向关系；2、实时定量PCR检测miR-34c和ACSL1在不同状态的HSC中的表达水平。第三部分：下调HSC中miR-34c表达对ACSL1表达及对HSC活化相关指标的影响1、使用miR-34c inhibitor转染活化态HSC（培养至第14天者），同时用空白组、NC组作为对照，并采用萤光转染指标剂检测转染效率；2、PCR检测转染后HSC中miR-34c和ACSL1的表达水平；3、Western-blot技术检测转染后HSC中ACSL1蛋白表达水平；4、利用实时定量PCR和Western-blot检测转染后HSC活化相关指标Type I collagen与α-SMAR mRNA及蛋白水平的表达。研究结果：1、本实验采用酶原位消化法和密度梯度离心法，每只SD大鼠可获得HSC约5-7×107； HSC在328nm紫外光的激发下发出黄绿色荧光，采用Desmin和α-SMA细胞免疫荧光法检测静止态和活化态HSC细胞（经鉴定其细胞纯度达到90%以上）。2、经萤光素酶靶向报告系统的验证，证实ACSL1是miR-34c的靶基因；实时定量PCR检测结果表明，miR-34c和ACSL1在不同状态HSC中的表达水平差异有统计学意义(P<0.01)。随着HSC的活化，miR-34c的表达水平显著增高；而ACSL1则受miR-34c的负性调控作用，其表达水平随着HSC的活化明显减少(P<0.01)。3、将miR-34c inhibitor转染到14天HCS（活化态）中，荧光转染指示剂检测显示转染效率达到90%以上,14天HCS转染miR-34c inhibitor后:（1）实时定量PCR检测显示miR-34c的表达量明显低于空白组和对照组（P＜0.01）；且（2）ACSL1mRNA的表达量明显高于空白组和对照组(P＜0.01）；（3）Western-blot技术检测ACSL1蛋白水平，ACSL1的表达量明显高于空白组和对照组；（4）分别利用实时定量PCR和Western-blot检测α-SMAR和Type I collagen的表达水平：其mRNA和蛋白表达水平均明显低于空白组和对照组（分别P＜0.01）。结论：经酶原位消化法和密度梯度离心法可从SD大鼠肝脏成功提取HSC，经鉴定：细胞纯度较高，状态良好，可为后续实验提供所需的细胞。miR-34c随着HSC的活化而表达增高，而其靶基因ACSL1受到miR-34c的负向调控，表达水平随着HSC的活化而降低。下调活化态HSC中miR-34c的表达，能使ACSL1表达水平增高，同时也会对HSC活化指标α-SMA和Type I collagen的表达产生影响，即两者表达量随miR-34c表达的下调而显著减少。因而，miR-34c可能是通过靶向调控ACSL1而影响HSC的活化状态，进而参与肝纤维化进程。