一研究背景动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病的共同发病基础。低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高是造成AS病理改变最重要的危险因素之一,LDL-C通过多种机制诱发AS。近20年的大型的临床随机实验已经证明,降低LDL-C能让病人在临床治疗中获益,因此,国内外指南均把降低LDL-C水平作为预防和治疗AS的一个重要手段。但是,临床上LDL-C水平达到指南要求的标准后,仅能降低患者30%的心血管事件,依然残留60-70%心血管事件发生率。因此,我们认为除了降低LDL-C的治疗手段外,寻找新的治疗靶点预防和治疗AS志在必行,而干预高密度脂蛋白(HDL)是预防和控制AS的一个很重要治疗靶点。流行病学资料表明,血清HDL-C浓度与冠心病(CAD)发病率呈负相关,HDL颗粒是AS的保护因素之一,升高HDL-C水平是抗AS的靶点之一。NCEPATPⅢ把HDL-C<40mg/dL当作冠心病的独立危险因素,血清HDL-C水平每升高1mg/dl,男性患者CAD的危险性降低2%,女性降低3%。然而,HDL颗粒与AS的关系比我想像中更加复杂,在载脂蛋白AI(apoA-I)转变为apoA-ⅠMilano人群中,HDL-C的水平降低,但其CAD的发生率也低；胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂torcetrapib虽然能升高HDL-C水平,但结果却增加了患者心脏事件发生率和全因死亡率。以上的资料显示,血清HDL-C水平并不能反映HDL的整体功能,正常功能的HDL具有抗AS的一系列作用,而功能受损的HDL(既失功能HDL)不仅缺乏正常HDL的功能,并且表现出了促AS进展的作用。HDL的心血管保护作用主要体现在逆胆固醇转运(Reverse Cholesterol Transport, RCT)及抗炎抗氧化功能。RCT是指HDL将外周细胞内多余的胆固醇转移到肝脏,肝脏将胆固醇以胆汁形式分泌进消化道,最后通过粪便排出体外。由于过多的胆固醇可使巨噬细胞等变成泡沫细胞而促进AS发生,因此逆胆固醇转运对人体来说尤为重要。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)和清道夫受体-BI(SR-BI)是RCT过程中两个最重要受体,在血清脂蛋白的生成和代谢以及维持细胞内胆固醇平衡中起着重要的作用。HDL的抗炎抗氧化作用同样在防止AS进展方面起到重要作用。血清对氧磷酶1(PON1)是由肝脏合成的糖蛋白,主要存在与HDL上,与HDL结合后防止HDL被氧化,增加HDL的抗氧化功能,发挥血管保护作用。髓过氧化物酶(MPO)是一种在中性粒细胞和单核细胞中含量丰富的血色素酶,MPO参与炎症反应的发生和发展,可以氧化修饰HDL上的apoA-Ⅰ,从而降低HDL抗炎抗氧化功能,同时还可以氧化LDL形成具有强致AS作用的Ox-LDL,降低MPO活性可以提高HDL的抗炎抗氧化能力,发挥抗AS作用。普罗布考(probucol)又名丙丁酚,化学名为4,4’-[(1-甲基亚乙基)双(硫基)]双[2,6一双(1,1-二甲基乙基苯酚],是一种独特的调脂药,临床上用于治疗高血脂症尤其是杂合子家族性高胆固醇血症。普罗布考具有高脂溶性,随脂蛋白颗粒进入机体组织中,普罗布考可以使患者皮肤黄色瘤消退,AS斑块缩小。但降低胆固醇的同时,普罗布考也降低了血清HDL-C水平,为什么普罗布考降低了HDL-C后仍能发挥强大的抗动脉硬化效果,其中机制尚未完全清楚。我们课题组成员去年对普罗布考改善HDL的RCT功能的机制做了相关研究,但是关于普罗布考是否促进主动脉斑块内细胞及肝细胞ABCA1、SR-B1表达,通过何种机制改善HDL抗炎抗氧化功能尚未进行深入探讨。二研究目的本研究通过建立AS模型,观察经普罗布考处理后的AS兔主动脉斑块内细胞及肝细胞ABCA1、SR-BI的表达情况,以反映HDL的RCT能力；检测血清PON1和MPO活性探讨普罗布考改善HDL抗炎抗氧化作用的机制；检测血脂、主动脉内中膜厚度(IMT)和动脉斑块/血管面积比的变化情况,以确定其抗AS的效果。通过分析普罗布考对上述指标的改变情况,从而探讨其通过何种机制改善HDL功能并发挥抗AS作用。三实验方法1、实验分组18只新西兰健康雄性大白兔(体重2.0±0.11Kg,合格证号：scxk粤2006-0015)随机分为：(1)正常对照组(n=6)：给予普通饲料喂养；(2)AS组(n=6)：给予高脂饲料喂养；(3)普罗布考组(n=6)：在饲以高脂饮食基础上给予普罗布考400 mg/(kg·d)。2、血脂检测分别于实验第0周和第12周取静脉血,酶法测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平3、HDL抗炎抗氧化功能的检测采用分光光度计法测定血清PON1活性及血清MPO活性。4、ABCA1及SR-B1受体mRNA及蛋白表达水平检测(1)肝组织总RNA的提取用Trizol提取法,实时荧光定量PCR (RT-PCR)进行相对定量检测肝组织ABCAl及SR-BI的mRNA的表达量。(2)免疫组化法标记主动脉ABCAl及SR-BI受体表达情况,使用Image proplus 6.0图片分析软件分析主动脉壁上ABCAl或SR-B1表达情况：ABCA1和SR-BI表达面积百分比(%),ABCA1和SR-BI表达平均光密度值。5、病理组织学观察主动脉斑块形成情况实验第12周收集主动脉标本,甲醛固定液固定,常规制组织石蜡切片,苏木素-伊红(HE)染色,显微镜下观察其组织病理改变,并测量其内中膜厚度(IMT)及动脉斑块/血管面积比。四结果1、实验开始时(0周),取兔静脉血查血脂四项示：各组动物间TC(F=0.921,P=0.420), TG(F=0.453,P=0.644), LDL-C(F=0.003, P=0.997)和HDL-C(F=0.338,P=0.718)的差异无统计学意义,入选实验动物基线统一。实验12周以后,在消除实验开始时血脂四项指标的影响后,各组进行组间比较：与对照组相比,AS组血清TC (23.26±3.30 vs1.79±0.21, P=0.000)、TG (1.58±0.25 vs 1.02±0.15, P=0.000)、LDL-C (18.09±4.04 vs 1.09±0.23, P=0.000)、HDL-C (1.11±0.09 vs0.45±0.12,P=0.000)水平显著升高。与AS相比,普罗布考组TC(16.70±0.70 vs23.25±3.30, P=0.000)、LDL-C(13.79±2.01 vs 18.09±4.04, P=0.015)和HDL-C(0.51±0.06 vs 1.11±0.09, P=0.000)水平显著降低,差异具有统计学意义；但两组间血清TG(1.60±0.17 vs 1.58±0.25,P=0.826)差异无统计学意义。3组进行0周与12周组内比较：正常对照组干预前后TC(1.85±0.12 vs1.79±0.21, t=0.538, P=0.614)、TG (1.04±0.19 vs 1.02±0.15, t=0.162, P=0.878)、LDL-C (1.00±0.20 vs 1.09±0.23, t=0.566, P=0.0.596)、HDL-C (0.47±0.12 vs0.45±0.12,t=0.369,P=0.0.727)无显著改变,普通饲料喂养前后血脂无显著变化。AS组干预前后：TC (1.77±0.15 vs 23.26±3.30, t=16.603, P=0.000), TG (1.10±0.14 vs 1.58±0.25, t=4.498, P=0.006), LDL-C (1.00±0.20 vs 18.09±4.04, t=10.251, P=0.000), HDL-C (0.48±0.12 vs 1.11±0.09, t=14.615, P=0.000)显著改变,高脂饲料对血脂影响显著,AS模型成功建立。普罗布考组干预前后：TC(1.76±0.11 vs16.70±0.70, t=48.680,P=0.000), TG (1.02±0.15 vs 1.60±0.17, t=6.956,P=0.001), LDL-C (1.00±0.15 vs 13.79±2.01,1=16.244, P=0.000)显著改变,但是HDL-C(0.43±0.10 vs 0.51±0.06, t=1.612, P=0.168)无显著影响。2、实验12周,三组兔PON1活性变化(F=29.24,P=0.000)：与正常对照组(96.77±5.58 U/m1)比较,AS组(72.26±12.03 U/m1)血清PON1活性显著降低(P=0.001),而普罗布考组(118.20±12.21 U/m1)较AS组显著升高(P=0.000),差异具有统计学意义。三组兔MPO活性变化(F=46.994,P=0.000)：与正常对照组(14.94±6.36 U/L)比较,AS组(85.67±17.92 U/L)血清MPO活性显著升高(P=0.001),而普罗布考组(44.11±10.65 U/L)较AS组显著降低(P=0.000),差异具有统计学意义。3、实验12周,肝细胞ABCA1(F=32.904,P=0.000)及SR-B1(F=48.993,P=0.000) mRNA表达情况：与正常组ABCA1 (1.00±0.03) mRNA和SR-BI(1.00±0.02)mRNA相比,AS组ABCA1 mRNA (0.61±0.12, P=0.000)和SR-BImRNA (0.63±0.11, P=0.000)表达量显著减少,差异有统计意义；与AS组相比,普罗布考组ABCA1 mRNA(0.87±0.08,P= 0.000)和SR-BI mRNA(1.34±0.13,P=0.000)表达量显著增加,差异有统计意义。4、实验12周,免疫组化染色观察主动脉ABCAl及SR-B1表达情况：与AS组比较,普罗布考组的主动脉斑块内ABCAl表达面积百分比(%)(45.25±11.22% vs 24.13±9.85%,t=3.464,P=0.006)和SR-BI表达面积百分比(%)(46.22±11.56% vs 18.81±7.58%,t=4.858,P=0.001)增加,差异具有统计学意义。与AS组比较,普罗布考组主动脉斑块内SR-BI表达平均光密度值升高(0.25±0.04 vs 0.18±0.03,t=3.286,P=0.001),差异具有统计学意义；虽然ABCAl表达平均光密度值增高,但差异无统计学意义(0.19±0.03 vs 0.17±0.03,t=1.405,P=0.190)。5、实验12周,HE染色观察主动脉内中膜厚度及斑块面积的组织病理学特点：三组主动脉内中膜厚度(IMT)显著改变(F=52.83,P=0.000),与正常对照组(203.20±30.61 um)比较,AS组(527.41±85.16 um)IMT(P=0.000),差异有统计学意义。与AS组比较,普罗布考组(239.83±50.51 um)IMT(P=0.000),差异均有统计学意义。正常对照组主动脉壁未发现粥样硬化斑块,故只测量AS组和普罗布考组斑块／血管内膜表面积百分比,与AS组(27.77±12.01%)相比,普罗布考组斑块／血管内膜表面积百分比(5.92±3.38%)显著减小,差异具有统计学意义(t=4.289,P=0.002)。五结论1.普罗布考降低AS兔血清TC、LDL-C、HDL-C水平。2.普罗布考通过上调AS兔主动脉斑块内细胞及肝细胞SR-BI、ABCA1的表达,增强逆胆固醇转运(RCT)作用。3.普罗布考通过增加血清PON1活性,降低血清MPO活性从而增强HDL抗氧化、抗炎功能。4.普罗布考明显减轻AS状态下的主动脉内中膜厚度(IMT)及斑块／血管内膜表面积百分比,具有抗AS作用。5.血清HDL-C水平并不能准确代表HDL功能,虽然普罗布考降低HDL-C,但增强了HDL功能：通过增强主动脉斑块细胞及肝细胞SR-BI、ABCA1的表达及提高血清PON1、降低MPO活性提高HDL功能,减轻动脉粥样硬化。