论文部分内容阅读
在人们的日常饮食中,平均每天黄酮的摄入量大约在150毫克到300毫克之间,这其中大约有10%来自一种最常见的水果,柑橘。柑橘的主要成分是酚类化合物,氨基酸、挥发油、果胶、胡萝卜素、类黄酮和维生素C。橘子中的多种化合物和我们健康有着密切的联系,尤其是橘皮黄酮展示出的增加血清中抗氧化能力,防止脂质过氧化、减少老年人的氧化应激、抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥状硬化、作为化疗的辅助药物、作为糖尿病患者的保健食品以及神经保护作用等一系列广泛的生物学功能,越来越引起人们的注意。本课题首先通过MTT法探究六种不同橘皮化合物5-Acetyloxy-6,7,8,4’-tetramethoxyflavone (5-ATAN), Hesperidin(HPD), Nobiletin(NOB),Sinesetin(SIN),E为Tangeretin(TAN),5,6,7,4’–Tetramethoxyflavone(TMF)对人源乳腺导管腺癌MCF-7细胞作用24后的细胞存活率。筛选到一种在很低浓度便可以抑制MCF-7细胞活性的化合物5-Acetyloxy-6,7,8,4’-tetramethoxyflavone(5-ATAN)。5-ATAN的IC50最小为5.51μM,即表示在5.51μM浓度的情况下,5-ATAN作用MCF-7细胞24小时后细胞抑制率为50%。相比TAN,5-ATAN只是在TAN的第5位碳原子上修饰了一个乙酰基团,其抑制率便大大增加。反复加热和干燥生产的陈皮能转换TAN成为一种与其相似的化合物即在Tangeretin的主环的C5位上的甲基被乙酰基团所替代,便是5-ATAN,而5-ATAN又是陈皮中大量含有的化合物之一。本实验进一步探究5-ATAN对乳腺癌MCF-7细胞的影响,包括促进凋亡的作用和抑制增殖的作用两方面。结果表明,在5-ATAN作用MCF-7细胞不同时间后,既出现了对细胞核增殖抗原PCNA的抑制现象又出现了诱导MCF-7细胞的DNA断裂及细胞核皱缩等一系列的凋亡现象。在随后的研究中,本课题着重于凋亡作用的研究,实验结果表明,在5-ATAN介导的MCF-7细胞的凋亡中,Caspase依赖的信号通路和Caspase非依赖的信号通路都有所涉及,在Caspase非依赖的信号中,本课题采用免疫荧光的方法观察到AIF的核转位,并用WesternBlot的方法检测到H2AX的磷酸化;在Caspase依赖的信号通路中,本实验首先采用WesternBlot观察到Caspase依赖的信号通路的中Caspase家族重要的执行者Caspase-3的活化和Caspase–3的下游靶蛋白PARP的活化,随后在5-ATAN作用MCF-7细胞较短的时间内,检测Caspase依赖的两条凋亡信号通路的上游限号,本课题通过WesternBlot法观察到,死亡受体的相关的外源性凋亡通路并不发生明显的活化;而线粒体相关的内源性凋亡通路活化明显,包括促凋亡蛋白Bax的增加,抑制凋亡蛋白Bcl-2蛋白的减少,进而使得线粒体膜电位下降,细胞色素C从线粒体释放到细胞质中,激活Caspase-9最后激活Caspase-3,使得活化PARP活化产生大量的DNA片段。为了更加充分地证明5-ATAN介导MCF-7细胞的凋亡途径中,Caspase依赖的线粒体介导的内源性途径参与到其中,本课题通过5-ATAN与Caspase特异性的联合抑制剂。结果表明Caspase广泛抑制剂Z-VAD-FMK并不能完全逆转5-ATAN对MCF-7的抑制其存活的作用,暗示着除了Caspase依赖的信号通路参与到其中来,如Caspase非依赖的细胞凋亡信号通路,凋亡以外如自噬,抑制增殖等值得更为深入的研究。联合Caspase–9的抑制剂Z-LEHD-FMK发现,与Caspase广泛抑制剂组并没有统计学意义,结果表明在5-ATAN介导的MCF-7细胞的Caspase依赖的信号通路,Caspase–9所关联的Caspase依赖性的内源性途径占绝大部分。