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目的通过体内、体外实验,探究血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)在高糖致骨质疏松症的生物学作用;通过体外筛选抑制肾素(Renin)/Ang Ⅱ轴的中药活性单体,揭示其体内防治糖尿病性骨质疏松症的药效。方法1.Ang Ⅱ对高糖环境下成骨细胞、破骨细胞分化与功能的作用在高糖环境下(30 m M)体外培养小鼠源前成骨细胞MC3T3-E1、小鼠源单核巨噬细胞RAW264.7以及原代培养小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMMs),在体外诱导成骨细胞、破骨细胞的分化形成过程中,使用Ang Ⅱ及Ang Ⅱ的I型受体(AT1R)拮抗剂奥美沙坦进行干预。2.AT1R拮抗剂对高血糖SHR大鼠骨组织的作用选择3月龄雄性自发性高血压大鼠(SHR),经单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ,60 mg/kg)制备高血糖模型,以AT1R拮抗剂缬沙坦(5 mg/kg)灌胃给药8周。每两周测定体重、空腹血糖(FBG)、血压;收集血清,待检测骨代谢生化指标;通过HE、TRAP染色观察骨组织形态;使用Micro-CT检测胫骨松质骨的骨量;使用生物力学测试仪检测胫骨皮质骨的骨力学参数;通过western-blotting检测骨组织RAS组分Renin、Ang Ⅱ蛋白表达。3.体外筛选调控Renin活性、Ang Ⅱ的表达的中药单体并进行体内验证通过中英文文献调研并配合体外活性筛选,应用转染人源Renin的HEK-293T细胞模型,筛选能够抑制Renin活性、下调Ang Ⅱ蛋白表达的中药活性单体,并进一步进行体内实验验证。结果1.高糖环境下Ang Ⅱ抑制成骨细胞分化、促进破骨细胞分化在高糖环境下,Ang Ⅱ通过抑制成骨转录因子RUNX2、骨基质蛋白COL-1、促骨矿化蛋白OCN的表达,抑制成骨细胞的分化(降低ALP活性)、矿化(降低矿化结节);Ang Ⅱ通过上调破骨吸收相关蛋白MMP-9、Cathepsin K的表达,促进破骨细胞的生成,增强破骨吸收活性。2.AT1R拮抗剂对糖尿病SHR大鼠骨组织没有明显改善作用与糖尿病SHR大鼠相比,缬沙坦对糖尿病大鼠体重、血糖均无显著影响,但能够显著降低糖尿病SHR大鼠收缩压、舒张压;显著提高血清磷含量,显著降低血清骨转换指标TRAc P-5b含量;骨组织形态学染色结果显示,缬沙坦减少糖尿病SHR大鼠松质骨部位破骨细胞数量;Micro-CT以及生物力学检测分析,发现缬沙坦对糖尿病SHR大鼠骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、最大载荷都没有显著改善作用;同时,缬沙坦能够上调糖尿病SHR大鼠骨组织Renin、Ang Ⅱ蛋白表达。3.体外筛选获得抑制Renin活性、下调Ang Ⅱ的表达的中药单体丹参酮ⅡA、槲皮素通过文献调研我们发现,锁定单味中药丹参、黄芪;再根据两味中药所含单体的主要化学结构并结合已报道的中药单体活性,共选择9个单体化合物进行体外活性筛选;发现丹参酮ⅡA和槲皮素处理HEK-293T细胞24小时后,呈剂量依赖性抑制Renin活性,且Ang Ⅱ的蛋白表达显著降低。4.丹参酮ⅡA、槲皮素改善糖尿病小鼠骨量丢失与糖尿病小鼠相比,丹参酮ⅡA、槲皮素显著降低糖尿病小鼠血清Ang Ⅱ含量,两个药物的高剂量组都能明显提高糖尿病小鼠胫骨BMD、BV/TV显著升高。此外,HE和TRAP组织形态学染色发现,丹参酮ⅡA、槲皮素能够改善糖尿病小鼠股骨松质骨的骨小梁微损伤,并且,减少股骨远端破骨细胞阳性染色数量。结论Ang Ⅱ在体外高糖环境下,能够抑制成骨细胞分化和成骨功能,激活破骨细胞骨吸收活性;由于AT1R拮抗剂负反馈上调糖尿病SHR大鼠骨组织Renin、Ang Ⅱ的表达,因此,对糖尿病SHR大鼠骨组织没有明显的保护作用;槲皮素、丹参酮ⅡA能够有效抑制Renin活性、下调Ang Ⅱ的表达,并且,体内能够防治高血糖导致的小鼠骨丢失。