乳腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升,现居于肿瘤发病率的首位。根据病理学分类,可将乳腺癌分为HER2+型、luminal A型、luminal B型和三阴性乳腺癌。HER2+型乳腺癌是人类表皮生长因子受体2（HER2）过表达的一类乳腺癌亚型,占所有乳腺癌的20%～25%,相较于luminalA、luminalB型乳腺癌,该亚型预后差,易转移与复发。尽管曲妥珠单抗靶向药的应用为HER2+患者提供了具有显著疗效的治疗手段,但临床上依然存在广泛的耐药现象。因此,阐明HER2+乳腺癌发生发展与耐药机制是目前的研究热点之一。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度超过200nt的不编码蛋白质的RNA,过去常常被认为是非必要的转录本。然而,许多研究发现,lncRNA广泛参与多种生理病理过程。近年来研究表明,lncRNA在乳腺癌细胞干性和化疗耐药中发挥重要功能,可作为肿瘤标志物及治疗靶点。然而,lncRNA在曲妥珠单抗耐药性的调节机制到目前为止尚未完全明确。在前期研究中,课题组合作的美国密歇根大学实验室为本课题提供了一株三阴性乳腺癌曲妥珠单抗耐药细胞系BT474-PTEN-LTT（LTT）。在HER2+乳腺癌细胞系BT474中敲除第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN）并进行持续性曲妥单抗治疗后,发现其表型转化为TNBC细胞表型LTT,鉴定发现该细胞系具有间质性乳腺癌干细胞表型CD44+CD24-。我们对BT474与LTT进行RNA-seq和qRT-PCR,筛选并鉴定出一个在LTT中异常高表达lncRNA——linc00162。在此细胞系基础上,本研究将利用最新生物学技术开展乳腺癌干细胞生物学特性研究,探索其在乳腺癌转移、复发和耐药中的作用。本文第一部分以linc00162为研究对象,探究linc00162调控乳腺癌干细胞干性及其对曲妥珠单抗耐药的临床和分子机制。本研究首先明确了 BT474在转化为LTT细胞时发生了那些重要生物学特性的改变:BT474细胞系发生上皮-间质转化,丢失HER2蛋白并转化为富含干细胞表型CD44+CD24-的三阴性表型LTT细胞;耐药实验与增殖实验显示,与BT474细胞系相比,LTT细胞的曲妥珠单抗耐药性与增殖能力显著增强。TCGA数据库分析结果显示,linc00162在三阴性乳腺癌中表达显著高于其他非三阴性乳腺癌。我们通过体外功能实验发现linc001662可以促进乳腺癌细胞的增殖、自我更新能力。通过qPCR和Western bolt检测干性相关基因变化显示linc00162可促进SOX2、OCT4、NANOG这三种干性基因的表达。机制研究上,我们通过CHIP、NF-κB诱导与抑制实验等研究上游分子机制发现NF-κB可结合linc00162的启动子区从而上调linc00162的表达。随后我们进一步研究了 linc00162在乳腺癌细胞干性及曲妥单抗耐药性的分子机制。我们通过竞争性RNA pulldown以及RNA免疫共沉淀实验验证linc00162可以与UPF1、SYNCRIP以及NFIX特异性结合。截短体实验结果显示主要是linc00162 3’端467-749nt序列与UPF1、SYNCRIP相结合。通过体外功能实验证明UPF1可促进乳腺癌细胞的增殖及自我更新能力。Western bolt显示UPF1可促进OCT4、NANOG两种干性相关蛋白的表达。与linc00162的功能具有相似性。进一步机制研究发现,linc00162通过结合UPF1增加其蛋白稳定性,抑制其蛋白酶体依赖的泛素化降解途径。linc00162可能通过下调HER2的蛋白表达来介导HER2+型乳腺癌细胞转化为三阴性乳腺癌的过程。另外,通过共培养实验发现,linc00162可进行细胞-细胞间传递,我们推测linc00162可能与SYNCRIP结合被带入外泌体,进行胞间传递,进一步影响周围细胞的干性与耐药性。以上研究表明,linc00162通过调控UPF1在乳腺癌细胞的干性调控以及曲妥珠单抗耐药的过程中发挥重要的促进作用并可能通过结合外泌蛋白SYNCRIP以外泌体的形式进行胞间传递。我们后续将进一步完善linc00162在乳腺癌中调控乳腺癌细胞干性以及曲妥珠单抗耐药性的具体分子机制,为乳腺癌的诊断和治疗提供了具有潜在价值的分子标志物。第二部分主要是以NFIX为研究对象,探究NFIX在三阴性乳腺癌中的表达、临床相关性及其功能。三阴性乳腺癌预后差,复发风险,常发生化疗耐药,无明确的靶向治疗手段,是乳腺癌中恶性程度最甚的亚型。NFIX在三阴性乳腺癌中的干性相关功能与临床相关性未见报道。因此,明确NFIX在三阴性乳腺癌的作用具有重要的意义。首先,我们分析了 TCGA数据库中NFIX在各乳腺癌亚型的表达情况,发现NFIX在三阴性乳腺癌中表达高于其他三种乳腺癌亚型。另外,我们使用R包limma分析GEO数据库GSE76275基因表达谱,同样验证了在TNBC患者中NFIX的mRNA水平上调。随后,我们采用实时荥光定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹法检测NFIX在乳腺癌细胞系中的表达,结果显示NFIX在三阴性乳腺癌细胞系中表达水平明显高于其他非三阴性乳腺癌细胞系。进一步通过免疫组织化学方法检测三阴性乳腺癌组织中NFIX的蛋白表达水平,结果发现NFIX主要位于细胞核内,在TNBC组织中阳性表达率为40%（12/30）。并且临床相关性研究显示,NFIX阳性表达与淋巴结转移相关（χ 2=5.000,P=0.025）但与患者的年龄（P=0.176）、病理分级（P=0.073）、T分期（P=0.745）、临床分期（P=0.576）无关。我们通过Kaplan-Meier plot网站（www.kmplot.com）进行生存分析,结果表明NFIX高表达与TNBC患者较差总生存期（P＜0.05）和无复发生存期相关（P＜0.01）。以上结果提示了 NFIX与TNBC恶性表型的强烈相关性。因此,为了研究NFIX在三阴性乳腺癌细胞系中的功能,我们选择了 NFIX高表达的细胞系LTT和MDA-MB-468,使用特异性siRNA敲降NFIX后分析其对三阴性乳腺癌细胞迁移、侵袭、成球、增殖以及细胞凋亡的影响。使用siRNA敲降NFIX后结果显示,siRNA序列在两个细胞系中的敲降效率均达到70%以上。体外实验显示,敲降NFIX后显著抑制LTT细胞（P＜0.001）和MDA-MB-468（P＜0.01）细胞的迁移、侵袭能力。无血清成球结果实验显示,敲降NFIX后显著抑制了 LTT细胞的自我更新能力（P＜0.01）。细胞增殖实验显示,敲降NFIX后,LTT细胞（P＜0.01）和MDA-MB-468（P＜0.001）细胞的增殖能力收到抑制。细胞凋亡实验显示,敲降NFIX能促进LTT（P＜0.05）和MDA-MB-468（P＜0.01）细胞的凋亡。此外,分子机制研究发现,NFIX敲降后的LTT细胞和MDA-MB-468中的抗凋亡蛋白Bc12下调。提示NFIX通过调控Bc12的表达来抑制三阴性乳腺癌细胞的凋亡。进一步我们通过GSEA分析发现,NFIX高表达可在肿瘤相关通路、Wnt信号传导、粘着斑相关途径以及胞外基质受体相关通路中富集,提示NFIX可能参与Wnt信号传导、粘着斑以及肿瘤微环境的调节。综上所述,NFIX在TNBC组织、细胞中均高表达且NFIX在TNBC组织中表达与淋巴结转移及不良预后相关。体外实验发现,NFIX可促进三阴性乳腺癌细胞的迁移、侵袭、自我更新和增殖能力,并通调控Bcl2抑制细胞凋亡。GSEA结果表明,NFIX可能参与Wnt信号传导通路、粘着斑以及胞外基质受体相互作用相关信号通路的调节,为接下来NFIX可能参与的分子机制研究奠定基础。本研究结果提示NFIX可能作为三阴性乳腺癌患者预后的分子标志物,为三阴性乳腺癌治疗提供新的靶点。