基于单颗粒能量转移的探针设计与单细胞测量

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细胞是生命结构和功能的基本单元。明确单细胞内的物质运输和能量传递机制将扩展我们对疾病机制甚至是生命起源的认知。因此,在过去的几十年里,单细胞分析技术取得了快速的发展,其中光学分析法因其可实现无损和活细胞原位分析且兼具高时间和高空间分辨率的优点而得到了广泛关注。光学分析法的发展,高度依赖于发光探针的开发。现有的发光探针由于发射光谱峰较宽,在多通道分析中很容易造成光谱串扰。表面等离子体激光(Spaser)纳米探针的发射线宽很窄,可解决光谱串扰问题。但是由于目前所报道的Spaser探针激射阈值较高,很难和现有的光学分析仪器相兼容。并且如此苛刻的激发条件也很容易对细胞造成永久性损伤。另外,在单细胞热测量方面,虽然有不少工作报道了单细胞内的温度分布,但是对于单细胞热量传递方面的研究目前还几乎是空白。基于此,本文基于金纳米颗粒的能量转移原理,设计开发了一种低阈值的Spaser探针并设计搭建了瞬态传热显微镜系统,以Au纳米颗粒作为热扰动探针测量了单细胞内的传热特性,主要研究内容总结如下:1.开发了一种基于三能级系统的Spaser纳米探针。选用一种具有三能级的染料作为增益介质,利用极化偶极向Au纳米颗粒谐振腔的能量转移,制备了三能级系统的Spaser纳米探针。该探针的等离子体激光发射线宽约为3 nm,远小于目前所开发的普通荧光探针的发射线宽;激光发射寿命约为100μs,很容易避开细胞发光背景的干扰;激射阈值低至约1 m J·cm-2,已经可以和常规的生物分析仪器(如共聚焦显微镜等)相兼容。另外,基于此探针构建了Spaser-STED超分辨显微镜。该显微镜的空间分辨率约为74 nm,优于目前常用的共聚焦显微镜(286 nm)。所开发的Spaser探针在单细胞分析领域有广阔的应用前景。2.设计搭建了瞬态传热显微镜系统并建立了纳米微区传热系数的测量方法。本显微镜系统是基于泵浦探测技术的瞬态显微成像方法,具有较高的时间和空间分辨率。本显微镜系统使用Au纳米颗粒作为热扰动探针,利用被激光加热Au纳米颗粒向周围介质的能量转移来进行介质的传热测量。系统的空间分辨率主要取决于金纳米探针周围介质中热扩散层的厚度,而热层厚度与泵浦激光功率和热扩散时间有关。通过优化泵浦功率,可以将热场尺度减小到100 nm以内。瞬态显微镜的时间分辨率(即时间门宽度)约为5μs,本策略达到了迄今为止最高的时间分辨率(与以往的稳态或准稳态温度测量技术相比)。然后,使用所搭建的瞬态传热显微镜系统测量了纯水和甘油介质的传热系数,结果表明所搭建的瞬态传热测量系统具有较好的准确性和精密度(系统的总体误差约为10%)。所开发的瞬态传热显微镜结合了接近衍射极限的成像能力和微秒级的时间分辨能力,在研究细胞或亚细胞水平的超快热动力学事件方面极具优势。3.测量了单细胞的传热特性。共研究了人源HeLa、MCF-7和MCF-10A细胞,以及小鸡成纤维细胞,牛蛙成纤维细胞的传热特性。通过研究发现,这五种细胞内传热系数分布都是不均匀的,并且活细胞内的传热系数分布范围比固定细胞更广。接着,又探究了单细胞的传热特性与环境温度的关系,发现在活的温血动物细胞中存在一种散热特性的突变现象,即当环境温度高于细胞的最适温度时,细胞内的传热系数急剧增加。但是,对于活的冷血动物细胞,它的散热系数虽然也随着环境温度的升高逐渐增大,但是却没有这种突变调节的现象。并且,当活的恒温动物细胞被固定时,这种突变调节特性消失了。此现象表明,恒温动物可能存在单细胞层面的“主动”散热调节,它会根据环境温度改变传热系数,以确保细胞的热平衡。根据细胞代谢组学的分析结果,提出了人源细胞对散热特性调节的闭环控制理论:当外界温度高于体温时,细胞内的三羧酸(TCA)循环减弱,产热减少;同时,细胞内的精氨酸代谢增强,导致内皮舒张因子(NO)大量产生,刺激细胞加快散热。
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