【摘 要】
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研究背景肺癌是全球致死数最高的肿瘤类型。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌中最常见的病理分型,占肺癌总病例的约85%。肺癌早期无明显症状,缺乏早期诊断标志物,近70%NSCLC患者初诊时已处于中晚期,5年生存率较低。深入研究肺癌发生发展的分子机制,对寻找有效的早期诊断标志物和治疗靶点,有着重要的意义。丝氨酸/苏氨酸激酶AKT在多种肿瘤中异常激活,
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研究背景肺癌是全球致死数最高的肿瘤类型。非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌中最常见的病理分型,占肺癌总病例的约85%。肺癌早期无明显症状,缺乏早期诊断标志物,近70%NSCLC患者初诊时已处于中晚期,5年生存率较低。深入研究肺癌发生发展的分子机制,对寻找有效的早期诊断标志物和治疗靶点,有着重要的意义。丝氨酸/苏氨酸激酶AKT在多种肿瘤中异常激活,对肿瘤细胞的生存及增殖至关重要。过往研究发现NSCLC中约51%的肿瘤存在AKT活性增加,并可表现为AKT磷酸化水平升高和下游信号通路的激活,与NSCLC患者的不良预后密切相关。解析AKT磷酸化过程中的重要分子事件,可为开发靶向AKT激活的新药物、从而阻断AKT信号通路提供重要依据。基于以上研究背景,结合实验室前期AKT免疫沉淀的质谱分析结果提示在NSCLC中PKMYT1（膜相关的酪氨酸和苏氨酸蛋白激酶1,Protein kinase membrane associated tyrosine/threonine 1）可能是与 AKT 相互作用的潜在蛋白。为了探究PKMYT1与AKT的相互作用及PKMYT1对NSCLC的生物学影响,本文提出以下科学问题:PKMYT1是否与AKT结合?PKMYT1与AKT相互作用所引起的生物学效应是什么?PKMYT1对NSCLC产生哪些生物学效应?研究方法1.PKMYT1与AKT相互作用的情况研究（1）免疫共沉淀实验（Co-IP）、Far-Western Blotting实验验证PKMYT1和AKT的结合情况;（2）构建PKMYT1和AKT的截短型质粒,Co-IP实验检测PKMYT1与AKT结合的结构域;（3）Western blotting实验检测过表达或敲低PKMYT1对AKT T308和S473磷酸化水平的影响;（4）Co-IP实验检测PKMYT1对PDK1、ILK1结合AKT能力的影响;2.PKMYT1影响非小细胞肺癌生长情况的研究（1）体外实验:平板克隆形成实验、噻唑蓝检测细胞生长实验（MTT）、软琼脂克隆形成实验（Soft Agar）检测过表达或敲低PKMYT1对NSCLC细胞的体外生长情况影响;平板克隆实验、MTT实验、Soft Agar实验、EdU实验检测PKMYT1激酶域突变（N238A、D251A）对NSCLC细胞生长的影响;（2）体内实验:裸鼠皮下成瘤实验检测过表达或敲低PKMYT1对NSCLC细胞的体内成瘤能力的影响;研究结果1.PKMYT1结合AKT并降低AKT磷酸化水平（1）PKMYT1可以直接结合AKT。（2）PKMYT1的激酶域与AKT的催化域结合。（3）在NSCLC细胞中高表达PKMYT1下调AKT T308和S473磷酸化水平,敲低则相反。（4）PKMYT1 与 PDK1、ILK1 竞争性结合 AKT。2.PKMYT1抑制非小细胞肺癌生长（1）PKMYT1抑制NSCLC细胞的体内外生长。（2）PKMYT1 激酶域突变（N238A、D251A）逆转 PKMYT1 对 NSCLC 细胞生长的抑制。研究结论1.PKMYT1直接结合AKT,PKMYT1的激酶域结合AKT的催化域。2.PKMYT1通过与PDK1、ILK1竞争性结合AKT,抑制PDK1、ILK1对AKT的磷酸化。3.PKMYT1抑制NSCLC细胞的生长。4.PKMYT1激酶域的N238、D251位点介导PKMYT1抑制NSCLC的生长。
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