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目的:观测硝菔通结方对慢传输型便秘模型大鼠肠神经系统及结肠胶质细胞源性神经营养因子的影响,探讨硝菔通结方所代表的补肾益精法治疗慢传输型便秘的作用机制。
方法:1.随机将60只SD大鼠分为空白组10只,造模组50只。造模组大鼠用大黄粉混悬液叠加剂量灌胃三个循环,建立慢传输型便秘模型。通过检测首粒黑便排出时间判断造模成功与否。2.造模成功后,将剩余造模组大鼠分为模型组(Model)、莫沙必利组(MSBLZ)、原方组(YFZ)、硝菔通结方组(XFTJFZ),空白组(Control)大鼠同前,予以各组大鼠相应药物灌胃治疗4周。观测各组大鼠体重、首粒黑便排出时间、24h便量,取结肠组织,HE染色观察病理形态,AB-PAS观察粘液分泌情况,免疫荧光切片观察结肠GDNF、GFRα-1、Ret、RAI表达水平,铺片观察肌间神经丛组织形态,WesternBlot及RT-PCR检测结肠GDNF、GFRα-1、Ret蛋白和mRNA表达水平。
结果:1.相较于空白组,模型组大鼠体重增加减缓(P<0.01),首粒黑便排出时间明显增长(P<0.01),24h便量显著降低(P<0.01)。相较于模型组,莫沙必利组、原方组、硝菔通结方组大鼠体重增长变快(P<0.01),首粒黑便排出时间缩短(P<0.01),硝菔通结方组相较于原方组大鼠体重增长更快(P<0.01);莫沙必利组及原方组大鼠24h便量增多(P<0.05),硝菔通结方组大鼠24h便量明显增多(P<0.01)。
2.HE染色观察空白组大鼠结肠粘膜完整,腺体、肌层及肌间神经丛形态均正常;模型组大鼠结肠粘膜肿胀,有炎性改变,腺体排列杂乱,肌层纤维受损,神经细胞出现空泡且数量减少,肌层变薄;相较于模型组,莫沙必利组及原方组炎性变化较轻,仍存在部分肌纤维坏死及肌间神经丛病理性改变;硝菔通结方炎性浸润有改善,腺体形态正常,排列整齐,肌层较模型组增厚,肌纤维坏死及神经细胞空泡减少。
3.AB-PAS染色观察空白组大鼠肠道腺上皮细胞形态正常,粘膜层杯状细胞排列丰富且整齐;模型组大鼠肠道腺上皮细胞形态瘦小,粘膜层杯状细胞数量减少;相较于模型组,莫沙必利组及原方组粘膜层杯状细胞数量及粘液分泌量有所增加,硝菔通结方组大鼠肠道腺上皮细胞形态正常,粘液分泌量增加,杯状细胞数量明显增多且排列整齐。
4.免疫荧光铺片观察空白组大鼠结肠肌间神经纤维分布呈网状,神经元数量多且神经节大;模型组大鼠肌间神经丛网状结构不完整,神经元数量减少;相较于模型组,莫沙必利组大鼠神经元数量增多,肌间神经丛结构不甚完整;原方组大鼠肌间神经丛可见相对较完整的网状结构,但神经节较小;硝菔通结方组大鼠肌间神经丛可见较为完整的、呈网状分布的神经纤维,且神经元数量增多,神经节大小及形态也趋于正常。
5.相较于空白组,免疫荧光染色观察模型组大鼠GDNF、GFRα-1、Ret表达变弱,WesternBlot和RT-PCR检测模型组GDNF、GFRα-1、Ret蛋白和mRNA表达水平下降(P<0.01)。治疗后各组大鼠免疫荧光染色下GDNF、GFRα-1、Ret表达升高,WesternBlot和RT-PCR检测GDNF、GFRα-1、Ret的蛋白和mRNA表达水平相较于模型组均有不同程度的增多。相较于原方组,硝菔通结方组GDNF、GFRα-1、Ret蛋白表达水平均显著升高(P<0.01);GDNF、GFRα-1mRNA的表达水平明显提高(P<0.01),RetmRNA的表达水平升高(P<0.05)。免疫荧光染色观察各组RAI表达发现区别并不显著。
结论:1.慢传输型便秘模型大鼠结肠动力障碍与肠神经系统受损相关,胶质细胞源性神经营养因子与肠神经系统的损伤与修复相关。
2.硝菔通结方在治疗慢传输型便秘模型大鼠的过程中疗效良好,能有效改善便秘症状,促进结肠肌间神经丛损伤的修复。
3.硝菔通结方可能通过增加GDNF、GFRα-1、Ret、RAI的表达来促使肠神经胶质细胞增殖与修复,进而修复受损的肠神经系统,从而达到治疗慢传输型便秘的作用。该方所代表的补肾益精法发挥了重要作用。
方法:1.随机将60只SD大鼠分为空白组10只,造模组50只。造模组大鼠用大黄粉混悬液叠加剂量灌胃三个循环,建立慢传输型便秘模型。通过检测首粒黑便排出时间判断造模成功与否。2.造模成功后,将剩余造模组大鼠分为模型组(Model)、莫沙必利组(MSBLZ)、原方组(YFZ)、硝菔通结方组(XFTJFZ),空白组(Control)大鼠同前,予以各组大鼠相应药物灌胃治疗4周。观测各组大鼠体重、首粒黑便排出时间、24h便量,取结肠组织,HE染色观察病理形态,AB-PAS观察粘液分泌情况,免疫荧光切片观察结肠GDNF、GFRα-1、Ret、RAI表达水平,铺片观察肌间神经丛组织形态,WesternBlot及RT-PCR检测结肠GDNF、GFRα-1、Ret蛋白和mRNA表达水平。
结果:1.相较于空白组,模型组大鼠体重增加减缓(P<0.01),首粒黑便排出时间明显增长(P<0.01),24h便量显著降低(P<0.01)。相较于模型组,莫沙必利组、原方组、硝菔通结方组大鼠体重增长变快(P<0.01),首粒黑便排出时间缩短(P<0.01),硝菔通结方组相较于原方组大鼠体重增长更快(P<0.01);莫沙必利组及原方组大鼠24h便量增多(P<0.05),硝菔通结方组大鼠24h便量明显增多(P<0.01)。
2.HE染色观察空白组大鼠结肠粘膜完整,腺体、肌层及肌间神经丛形态均正常;模型组大鼠结肠粘膜肿胀,有炎性改变,腺体排列杂乱,肌层纤维受损,神经细胞出现空泡且数量减少,肌层变薄;相较于模型组,莫沙必利组及原方组炎性变化较轻,仍存在部分肌纤维坏死及肌间神经丛病理性改变;硝菔通结方炎性浸润有改善,腺体形态正常,排列整齐,肌层较模型组增厚,肌纤维坏死及神经细胞空泡减少。
3.AB-PAS染色观察空白组大鼠肠道腺上皮细胞形态正常,粘膜层杯状细胞排列丰富且整齐;模型组大鼠肠道腺上皮细胞形态瘦小,粘膜层杯状细胞数量减少;相较于模型组,莫沙必利组及原方组粘膜层杯状细胞数量及粘液分泌量有所增加,硝菔通结方组大鼠肠道腺上皮细胞形态正常,粘液分泌量增加,杯状细胞数量明显增多且排列整齐。
4.免疫荧光铺片观察空白组大鼠结肠肌间神经纤维分布呈网状,神经元数量多且神经节大;模型组大鼠肌间神经丛网状结构不完整,神经元数量减少;相较于模型组,莫沙必利组大鼠神经元数量增多,肌间神经丛结构不甚完整;原方组大鼠肌间神经丛可见相对较完整的网状结构,但神经节较小;硝菔通结方组大鼠肌间神经丛可见较为完整的、呈网状分布的神经纤维,且神经元数量增多,神经节大小及形态也趋于正常。
5.相较于空白组,免疫荧光染色观察模型组大鼠GDNF、GFRα-1、Ret表达变弱,WesternBlot和RT-PCR检测模型组GDNF、GFRα-1、Ret蛋白和mRNA表达水平下降(P<0.01)。治疗后各组大鼠免疫荧光染色下GDNF、GFRα-1、Ret表达升高,WesternBlot和RT-PCR检测GDNF、GFRα-1、Ret的蛋白和mRNA表达水平相较于模型组均有不同程度的增多。相较于原方组,硝菔通结方组GDNF、GFRα-1、Ret蛋白表达水平均显著升高(P<0.01);GDNF、GFRα-1mRNA的表达水平明显提高(P<0.01),RetmRNA的表达水平升高(P<0.05)。免疫荧光染色观察各组RAI表达发现区别并不显著。
结论:1.慢传输型便秘模型大鼠结肠动力障碍与肠神经系统受损相关,胶质细胞源性神经营养因子与肠神经系统的损伤与修复相关。
2.硝菔通结方在治疗慢传输型便秘模型大鼠的过程中疗效良好,能有效改善便秘症状,促进结肠肌间神经丛损伤的修复。
3.硝菔通结方可能通过增加GDNF、GFRα-1、Ret、RAI的表达来促使肠神经胶质细胞增殖与修复,进而修复受损的肠神经系统,从而达到治疗慢传输型便秘的作用。该方所代表的补肾益精法发挥了重要作用。