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研究背景WD是少数可以治疗的神经系统遗传病之一,患者如果在发病后能得到及时诊治,大多可获得较好疗效。但目前主要以青霉胺(Penicillamine,PCA)为代表的金属络合剂驱铜治疗对已存在严重神经症状的WD患者往往难以奏效,究其原因,驱铜治疗虽可纠正WD铜代谢障碍引起的体内铜的正平衡,但不能终止铜诱导的脑内神经元的损伤。因此,研究WD铜诱导的神经元损伤机制及其治疗的分子靶点,是脑型WD患者的诊疗亟待解决的难题。上世纪70年代以来,本课题单位以中药肝豆汤治疗WD患者获得良好疗效,并针对脑型WD患者,在原方肝豆汤基础上加芍药、茱萸、三七等活血养髓之品,以“通腑养髓”法进行治疗,获一定疗效。在前期研究中虽已发现肝豆汤方具有显著的清除自由基、抗氧化等神经保护作用,但其对铜诱导神经元损伤的具体保护机制尚不明确。本研究假设“通腑养髓”法之改良肝豆汤改良方从XIAP通路阻断铜诱导的细胞凋亡从而起到神经元保护的作用,以WD模型-tx小鼠为研究对象,拟采用免疫组织化学技术(immunohistochemistry)、实时荧光定量PCR(Real-timePCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)等技术观察肝豆汤改良方调控神经元损伤胞内信号传导通路中XIAP、Caspase-9及Caspase-3蛋白的表达水平,从分子水平阐明“通腑养髓”法之肝豆汤改良方保护高铜诱导神经元细胞凋亡变性的分子信号机制及其分子靶点,为制定疗效好、副反应低的脑型WD患者提供依据。研究目的1观察肝豆汤改良方治疗前后WD模型tx小鼠脑组织Cu2+、Zn2+等微量元素的改变,了解tx小鼠Cu、Zn铜代谢指标水平以及肝豆汤改良方对其调节作用。2观察肝豆汤改良方治疗前后WD模型-tx小鼠肝功能的改变,了解肝豆汤改良方的疗效及不良反应。3观察肝豆汤改良方治疗前后WD模型-tx小鼠脑组织XIAP、Caspase-9及Caspase-3mRNA和蛋白的表达水平,探讨Caspase依赖的细胞凋亡信号通路参与WD脑损伤的作用机制,以及肝豆汤改良方调节上述信号通路的脑损伤保护机制,确定肝豆汤改良方治疗WD脑损伤的分子靶点。研究方法1随机选取1月龄tx小鼠140只,随机分为肝豆汤改良方治疗组(40只),丁苯酞组(40只),模型组(60只),治疗组每日分两次予中药0.2ml/10g/次灌胃给药,连续2~4月;模型组每日分两次予生理盐水各0.2ml/10g/次灌胃,连续2~4月;丁苯酞组将每0.1g药物溶于12.5ml麻油中,每日分两次予丁苯酞0.2ml/10g/次灌胃给药,连续2~4月;随机选取正常1月龄DL小鼠60只,每日分两次予生理盐水各0.2ml/10g/次灌胃,连续2~4月。2通过原子吸收分光光度计检测各组WD模型-tx小鼠血清及脑组织中铜、锌微量元素的含量。3检测各组WD模型-tx小鼠治疗前后肝功能,观察其差异,了解肝豆汤改良方对tx小鼠的疗效及不良反应。4通过免疫组化法、RT-PCR法和Western-Blot法检测各组WD模型-tx小鼠脑组织中XIAP、Caspase-9及Caspase-3mRNA和蛋白的表达水平。研究结果1肝豆汤改良方对WD模型-tx小鼠铜相关微量元素代谢的影响1.1血清铜:肝豆汤改良方治疗组tx小鼠血清铜较同月龄模型组tx小鼠血清铜显著增高(P<0.01),与同月龄丁苯酞组比较无显著变化(P>0.05);模型组tx小鼠血清铜较同月龄正常DL小鼠显著降低(P<0.01)。1.2血清锌:肝豆汤改良方治疗组tx小鼠血清锌较同月龄模型组tx小鼠血清锌轻度降低(P>0.05),与同月龄丁苯酞组比较无显著变化(P>0.05);模型组tx小鼠血清锌较同月龄正常DL小鼠显著降低(P<0.01)。1.3脑组织铜:肝豆汤改良方治疗组tx小鼠脑组织铜较同月龄模型组tx小鼠脑组织铜显著降低(P<0.01),与同月龄丁苯酞组比较无显著变化(P>0.05);模型组tx小鼠脑组织铜较同月龄正常DL小鼠显著增加(P<0.01)。1.4脑组织锌:肝豆汤改良方治疗组tx小鼠脑组织锌较同月龄模型组tx小鼠脑组织锌轻度增加(P>0.05),与同月龄丁苯酞组比较无显著变化(P>0.05);模型组tx小鼠脑组织锌较同月龄正常DL小鼠显著增加(P<0.01)。2肝豆汤改良方对WD模型-tx小鼠血清肝功能的影响:模型组tx小鼠血清AST及ALT较同月龄正常DL小鼠显著增高(P<0.01),肝豆汤改良方治疗组tx小鼠血清AST及ALT较同月龄模型组tx小鼠血清AST显著降低(P<0.01);模型组tx小鼠血清TBA较同月龄正常DL小鼠显著增高(P<0.01);肝豆汤改良方治疗组tx小鼠血清TBA较同月龄模型组tx小鼠血清TBA显著降低(P<0.01);3肝豆汤改良方对WD模型-tx小鼠细胞凋亡相关信号通路的影响3.1免疫组化法检测XIAP、Caspase-9及Caspase-3蛋白的表达:脑组织免疫组化检测发现各蛋白在各组均可见棕或黄色阳性表达。在脑组织中,XIAP蛋白阳性表达信号于细胞质内可见,Caspase-9和Caspase-3蛋白阳性表达信号于胞浆内可见。XIAP蛋白在肝豆汤改良方治疗组表达较同月龄模型组相对较多,Caspase-9和Caspase-3蛋白在肝豆汤改良方治疗组表达较同月龄模型组相对较少。3.2RT-PCR法检测XIAP、Caspase-9及Caspase-3mRNA的表达:正常组-DL小鼠脑组织中XIAP、Caspase-9和Caspase-3mRNA的表达水平组内比较均无明显变化(P>0.05);模型组-tx小鼠3月龄脑组织中XIAP mRNA表达较1月龄下调(P<0.01),5月龄脑组织中XIAP mRNA表达与3月龄比较无显著变化(P>0.05),模型组-tx小鼠随月龄的增加,脑组织中Caspase-9和Caspase-3mRNA的表达分别呈上调趋势(P<0.05);丁苯酞对照组-tx小鼠随月龄的增加,脑组织中XIAP、Caspase-9及Caspase-3mRNA的表达水平组内比较均无明显变化(P>0.05);肝豆汤改良方治疗组-tx小鼠随月龄的增加,脑组织中XIAP、Caspase-9及Caspase-3mRNA的表达水平均无显著变化(P>0.05);模型组tx小鼠脑组织XIAP mRNA的表达较同月龄正常组DL小鼠显著下调(P<0.01),模型组tx小鼠脑组织中Caspase-9和Caspase-3mRNA的表达分别较同月龄正常DL小鼠显著上调(P<0.01);肝豆汤改良方治疗组tx小鼠脑组织中XIAP mRNA的表达较同月龄模型组tx小鼠明显上调(P<0.01),肝豆汤改良方治疗组tx小鼠脑组织中Caspase-9和Caspase-3mRNA的表达分别较同月龄模型组tx小鼠明显下调(P<0.01);肝豆汤改良方治疗组tx小鼠脑组织中XIAP、Caspase-9及Caspase-3mRNA的表达与同月龄的丁苯酞组比较无显著变化(P>0.05)。3.3Western-Blot法检测XIAP、Caspase-9及Caspase-3蛋白的表达:正常组DL小鼠脑组织中XIAP、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表达水平组内比较均无明显变化(P>0.05);模型组-tx小鼠3月龄脑组织中XIAP蛋白的表达较1月龄下调(P<0.01),5月龄脑组织中XIAP蛋白的表达与3月龄比较无显著变化(P>0.05),模型组-tx小鼠随月龄的增加,脑组织中Caspase-9和Caspase-3蛋白的表达分别呈上调趋势(P<0.05);丁苯酞对照组-tx小鼠随月龄的增加,脑组织中XIAP、Caspase-9及Caspase-3蛋白的表达水平组内比较均无明显变化(P>0.05);肝豆汤改良方治疗组-tx小鼠随月龄的增加,脑组织中XIAP、Caspase-9及Caspase-3蛋白的表达水平均无显著变化(P>0.05);模型组tx小鼠脑组织XIAP蛋白的表达较同月龄正常组DL小鼠显著下调(P<0.01),模型组tx小鼠脑组织中Caspase-9和Caspase-3蛋白的表达分别较同月龄正常DL小鼠显著上调(P<0.01);肝豆汤改良方治疗组tx小鼠脑组织中XIAP蛋白的表达较同月龄模型组tx小鼠明显上调(P<0.01),肝豆汤改良方治疗组tx小鼠脑组织中Caspase-9和Caspase-3蛋白的表达分别较同月龄模型组tx小鼠明显下调(P<0.01);肝豆汤改良方治疗组tx小鼠脑组织中XIAP蛋白的表达较同月龄的丁苯酞组比较显著上调(P<0.05),肝豆汤改良方治疗组tx小鼠脑组织中Caspase-9和Caspase-3蛋白的表达与同月龄的丁苯酞组比较无显著变化(P>0.05)。结论1肝豆汤改良方可以降低tx小鼠脑组织铜的含量及调节锌的代谢,可能是改善脑损伤的一个重要原因。2肝豆汤改良方可改善tx小鼠的肝功能,表明肝豆汤改良方能改善铜对肝脏引起的损害,且不良反应较低。3铜沉积可诱导tx小鼠脑组织Caspase-9和Caspase-3蛋白的激活,表明铜诱导神经元的凋亡与Caspase依赖的细胞凋亡信号通路有关。4铜沉积可导致tx小鼠脑组织内XIAP蛋白表达下调,表明铜可能与XIAP蛋白结合,降低XIAP蛋白的表达,从而导致神经元凋亡。5肝豆汤改良方可下调tx小鼠脑组织内Caspase-9和Caspase-3蛋白的表达,表明肝豆汤改良方能抑制Caspase依赖的细胞凋亡信号通路,而抑制神经元的凋亡。6肝豆汤改良方可上调tx小鼠脑组织内XIAP蛋白的表达,表明肝豆汤改良方降低脑组织内铜的含量,使铜与XIAP蛋白的结合减少,从而抑制神经元的凋亡。