阿霉素是临床上治疗三阴性乳腺癌的一线用药,但其心脏毒性很大,并且极易产生耐药性,临床预后较差。肿瘤微环境中高表达的CD73蛋白可能与这种获得性耐药性有关,将CD73抗体和阿霉素联合运用可以解决这一临床难题。因此本课题将脂质体设计为具有pH敏感性的载体,阿霉素（DOX）和CD73抗体联合装载在脂质体载体上,通过CD73抗体的主动靶向作用将制剂精确递送到肿瘤部位,使药物能够充分作用于肿瘤细胞。在本课题中,从制剂的设计到体内外的疗效均完整考察。首先是制剂特性研究,对制剂的物理化学特性进行研究;其次是体外细胞实验,从细胞层面对制剂的治疗效果进行初步探究;最后是体内实验,从动物层面对制剂的疗效和作用机制进行探究。以下是研究方法和内容:1.制剂的特性研究（1）:阿霉素脂质体制备完成后,将CD73抗体与磷脂DSPE-PEG3400-NHS通过酰胺结合的方式连接,并通过后插入法装载在阿霉素脂质体表面,制备成最终的制剂（联合装载阿霉素和CD73抗体脂质体,即CDL）。（2）:脂质体的表征特性。透射电子显微镜的结果表明联合装载阿霉素和CD73抗体脂质体（CDL）的外观较为规整,多呈圆形或近圆形;其粒径大小差别不大,分布较为均一;DOXLip和CDL的平均粒径分别为202.5±2.155nm和216.3±4.40 nm,其PDI为0.207±0.003和0.215±0.006,CD73抗体装载到阿霉素脂质体表面后,脂质体的粒径增大,ζ电位从-7.27±1.08mV变为-14.7±0.65 mV,表明CD73抗体连接到阿霉素脂质体上。共定位的实验结果显示抗体与脂质体在同一位置。对阿霉素脂质体和联合装载阿霉素和CD73抗体脂质体的包封率和载药量进行测定,阿霉素脂质体的结果分别为99.68±0.116%和9.79±0.126%,联合装载阿霉素和CD73抗体脂质体的结果分别为99.8±0.140%和9.8±0.147%。从结果可以看出CD73抗体连接到阿霉素脂质体表面后,药物的包封率和载药量较为稳定。（3）:联合装载阿霉素和CD73抗体脂质体在体外环境中的释药行为,pH=7.4时,联合装载阿霉素和CD73抗体脂质体几乎没有释放药物,在72 h的累积释放速率为23.15±0.5%,这表明联合装载阿霉素和CD73抗体脂质体在中性条件下具有显著的稳定性,可以更好的将阿霉素以及CD73抗体递送到肿瘤部位;而在pH=5.0的PBS溶液中,免疫化疗脂质体中的阿霉素在72h的释放量可达到99.13±0.42%,表明联合装载阿霉素和CD73抗体脂质体具有pH敏感性,可以使阿霉素更好的富集于肿瘤部位,减少在其他器官的分布。2.CDL的细胞层面研究三阴性乳腺癌肿瘤微环境中的4T1肿瘤细胞在其表面大量表达CD73蛋白;将CD73蛋白的功能阻断后有可能逆转肿瘤微环境的免疫抑制;阿霉素是三阴性乳腺癌临床一线的药物,具有较为理想的临床效果。因此选择4T1细胞为本实验探究工具,评估不同制剂对4T1细胞的治疗效果。（1）:对CD73蛋白表达水平进行检测,证实CD73蛋白在4T1细胞表面高表达。（2）:细胞毒实验,采用CCK8法对制剂的毒性进行探究。结果显示空白脂质体的细胞活性高达90%以上,对正常细胞无毒性。在各制剂组的细胞毒性实验中,48 h时DOX Lip和CDL的IC50分别为6.72 μg/mL、4.02 μg/mL,证实具有主动靶向作用的CDL 比单纯阿霉素脂质体具有更理想的治疗效果。（3）:细胞凋亡实验,DOX Lip和CDL的凋亡诱导率分别为45.67±0.92%和58.3±5.37%,CDL明显高于DOXLip。（4）:细胞摄取实验,结果显示CDL的细胞摄取效率高于DOXLip,这是由于4T1细胞上CD73蛋白的高水平表达,而且CDL中的CD73抗体有主动的靶向活性。竞争性实验也进一步验证CD73抗体具有主动靶向作用。3.免疫脂质体的动物层面研究将4T1细胞接种于Balb/c小鼠第四对乳房垫内,构建小鼠原位三阴性乳腺癌模型,并对荷瘤小鼠进行了以下几个方面的研究:（1）:活体及离体器官成像研究,由于DOX具有自发荧光,所以我们直接运用DOX作为荧光探针。结果显示CDL组和DOX Lip组在肿瘤组织中大量累积,游离阿霉素组中药物在肿瘤组织中的分布较低,而且游离阿霉素在心脏的富集远高于制剂组。说明免疫化疗脂质体可以改变阿霉素在小鼠体内的组织分布,减少阿霉素在心脏中的累积,降低阿霉素的毒副作用。（2）:抑瘤率实验。通过抑瘤率实验对各制剂组进行药效学评价,结果显示CDL组中的肿瘤体积增长缓慢,具有良好的抑瘤效果,更好的发挥治疗作用。（3）:TUNEL的免疫组化染色与药效学结果一致,Ki67结果与TUNEL相似。证明DOX和CD73抗体联合运用会发挥协同作用,免疫化疗可显著增加抑瘤效果并降低毒副作用。4.制剂的安全性评价通过检测肝肾功能指标在血液中的水平高低评估制剂的安全性。结果发现对肝肾均未造成损伤;组织病理学检查表明,游离阿霉素组的心脏有部分水肿、坏死;PBS组和同型对照组中肺上肿瘤转移严重,这进一步说明制剂可抑制肿瘤的肺转移。肝肾的组织切片未有损伤,进一步表明CD73抗体和DOX联合装载脂质体（CDL）可降低毒副作用。5.阻断CD73细胞通路对于免疫微环境激活的影响我们研究了 CDL通过逆转免疫微环境促进4T1乳腺癌免疫治疗的机制。在肿瘤免疫治疗的范围内,诱导T细胞介导的强抗肿瘤反应需要三个先决条件:（1）ICD启动促进DC活化处理,并向T细胞呈现肿瘤特异性抗原;（2）随后的T细胞激活和记忆T细胞应答;（3）分泌Th1细胞因子。我们对这些关键标记免疫激活条件染色处理,结果表明,CD73蛋白可扭转肿瘤微环境的免疫抑制,激活免疫应答,使得免疫微环境中的免疫细胞和因子数量显著增加。