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小反刍兽疫（Peste des petits ruminants,PPR）是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性、烈性传染病,本病传播快,发病率、死亡率高,严重危害小反刍兽养殖业的发展。自1942年首次在西非发现该病后,目前全球已有40多个国家报告发生该病。我国曾在西藏地区局部发生该病,但2014年以来PPR在多省爆发流行,贵州省的8个地区均被波及,造成了养殖业的巨大经济损失。为了解贵州省小反刍兽疫流行特征和病原分子特征,本文开展了本病快速检测方法、流行病学、病原分子特征研究,为了解PPR贵州流行特征、病原分子特征提供理论资料,为PPR的综合防控措施制定提供理论依据。1.小反刍兽疫RT-PCR检测方法的建立:基于PPRV N基因序列设计并合成特异性引物,以小反刍兽疫病毒疫苗株RNA样本为模板,建立小反刍兽疫一步法RT-PCR检测体系,通过性能评价评估所建立小反刍兽疫一步法RT-PCR检测方法的可靠性。结果显示,本研究所建立的一步法RT-PCR检测方法能扩增N基因大小为447bp片段,与预期大小相符;最佳退火温度为60℃;最佳模板终质量浓度为6.76×10-3g/L;最小PPRV RNA检出质量浓度为6.76×10-6g/L,该方法的特异性、敏感性良好,能用于小反刍兽疫临床样本的检测。基于PPRV P基因设计并合成特异性引物及探针,以小反刍兽疫病毒疫苗株RNA样本为模板制备标质粒准品,建立Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR检测方法反应体系及其标准曲线,并对所建立方法进行性能评价,确定所建Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的可靠性。结果显示,所建Taq Man探针实时荧光定量RT-PCR检测方法能有效检测质粒标准品,形成典型的扩增曲线和标准曲线;对阳性标准品的最小检出浓度为1.7×102copies/μL,敏感性优于普通RT-PCR;组内重复试验和组间重复试验变异系数均低于2%,稳定性、特异性良好,能用于小反刍兽疫临床病例多种样本的检测和最佳检测样本的筛选。2.贵州省小反刍兽疫流行病学调查:收集贵州省毕节市、黔东南州、黔南州、铜仁市、六盘水市、遵义市、黔西南州、安顺市等8个市（州、县）养羊场的血清样本722份,疑似病例肺脏、淋巴结等组织样本122份,应用ELISA检测方法进行血清流行病学调查和RT-PCR方法进行病原流行病学调查,并基于N、H基因开展分子流行学调查。结果显示,未免疫羊群PPRV抗体阳性率平均达到26.3%（93/354）,全年多数月份均有PPRV隐性感染抗体阳性群体存在,其中3-5月份最高。免疫羊群平均抗体阳性率为59.0%（217/368）,羊群整体免疫情况不佳。来自于全省8个地区的样本均检测到PPRV核酸,平均阳性检出率为18.9%（23/122）。病例不同样本PPRV含毒量有所差异,其中肺脏样本可作为小反刍兽疫的最佳检测材料。N基因全长为1578bp,共编码525个氨基酸,来自贵州省8个地区PPRV流行株N基因同源性为92.2%～100%,与国内分离株同源性达到97.7%～99.6%,与国外分离株同源性介于88.5%～97.6%之间。N基因推导氨基酸序列变异主要集中在IV区（421～525的羧基末端区）;而H基因全长为1830bp,共编码609个氨基酸,来自贵州省8个地区PPRV流行株H基因同源性为88.9%～99.8%,与中国分离株同源性达到97.5%～99.8%,与国外分离株H基因同源性介于89.0%～98.2%之间。H基因推导氨基酸序列与其他毒株比较存在点突变,其中最为突出的是203位由亮氨酸（L）突变成甲硫氨酸（M）,315位由赖氨酸K突变成精氨酸（R）,450位由精氨酸（R）突变成赖氨酸（K）,546位由甘氨酸（G）突变成丝氨酸（S）。PPRV N、H基因遗传进行分析显示,PPRV贵州流行株与国内分离株在同一分支,属于第Ⅳ支系,不同于疫苗株Nigeria-75-1株所在的第Ⅰ支系。上述研究结果表明,PPR在贵州省范围内流行区域广,其中3-5月份高发。PRRV贵州流行株具有区域特征和一定的变异。3.小反刍兽疫病毒贵州流行株分离鉴定:取PPR阳性病例肺脏和淋巴结等样本,经处理后接种Vero细胞并盲传,并采用形态学观察、病原核酸检测、间接免疫荧光试验及电镜试验等方法对分离病毒进行鉴定。结果显示,阳性病料样本接种Vero细胞并盲传,能引起Vero细胞出现细胞病变,初期细胞间隙变大,部分细胞堆积成团,随后细胞开始变圆、收缩,并逐渐出现部分细胞溶解。RT-PCR鉴定显示,病毒细胞培养物第一代至第五代存在差异,从第六代开始逐渐稳定,均能检测到病毒核酸的存在。间接免疫荧光试验检测显示,细胞培养物中特异性的绿色荧光,反映出细胞中病毒抗原的存在。病毒细胞培养物经超薄切片后在透射电子显微镜下能观察到胞浆中电子致密的PPRV颗粒存在。上述实验结果表明,从临床阳性病例组织样本中分离到了PPRV,2株病毒分别命名为PPRV-GZPX株和PPRV-GZSY株。4.小反刍兽疫病毒贵州流行株基因序列分析:以两株PPRV贵州分离株为研究对象,针对PPRV全基因组设计7对引物,RT-PCR分别扩增针对PPRV全基因组的7个基因片段,经克隆测序后,用生物信息学软件进行拼接和序列分析。结果显示,PPRV贵州株全长15954bp,2株贵州分离株同源性为99.7%,与疫苗株Nigeria75-1株的同源性为92.1%。与国内分离株的全基因核苷酸序列达到了97.2%～99.7%。与国外分离株全基因同源性介于88.1%～97.1%之间。PPRV基因组全长15954bp,RNA链从3’至5’依次是N-P（C/V）-M-F-H-L 6个基因,共编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素（H）、大蛋白（L）6种结构蛋白和2种非结构蛋白（C/V）,各蛋白氨基酸序列均存在不同程度的变异,其中H基因变异最为明显。系统进化分析结果显示,贵州株与国内近年分离株处于同一分支内,均属于PPRVⅣ系,不同于疫苗株所处的Ⅰ系和非洲为代表的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ系。上述研究结果表明,PPRV全基因组长度稳定,但在局部存在明显的变异和点突变。PRRV贵州分离株与国内分离株关系近,多因国内引种存在相关性;与疫苗株存在明显差异,处于不同支系,在疫苗选择中应考虑毒株分子变化情况。