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抗体导向的酶催化前体药物疗法(ADEPT)是提高化学治疗药物对肿瘤选择性的有效途径。该疗法利用抗体与抗原、酶与底物的双重选择性提高抗癌药物的靶向性，在降低毒性的同时增强抗癌活性，提高治疗指数。但由于抗体-酶偶联物的分子量大且易产生免疫原性，使这种应用受到限制。
叶酸受体(FR)是一种通过聚糖磷脂酰肌醇(GPI)锚着在膜上的糖蛋白，在许多恶性肿瘤细胞高度表达，尤其是恶性卵巢癌，而在正常组织中的表达仅限于难于进入血液循环的上皮细胞顶膜，且FR的肿瘤表达密度随着肿瘤恶化程度的增加而增加。将叶酸受体的天然配体，维生素叶酸，与其他分子连接形成的叶酸偶联物能有效地，以叶酸特有的FR介导的内吞途径摄入细胞，且不会导致其亲和力降低。正是由于其表达的特异性及其配体独特优势，叶酸受体已成为肿瘤治疗的理想靶标。
与抗体相比，叶酸与叶酸受体的亲和力(Kd约0.1nM)比单克隆抗体对肿瘤细胞表面的受体亲和力强100倍以上，且叶酸具有免疫原性低、易于修饰、体积小(Mr=441.4Da)、易穿透肿瘤、化学和生物稳定性高、成本低、易贮存等优点。本课题以叶酸替代ADEPT中起导向作用的抗体，将叶酸与前药专一性活化酶偶联，酶被选择性靶向至FR表达阳性肿瘤，前药在酶的特异性催化下转化为活性细胞毒分子。这种联合叶酸介导靶向输送和ADEPT策略的新理念称为叶酸导向的酶催化前体药物疗法(FDEPT)。
本课题重点研究叶酸-青霉素G酰化酶偶联物(Folate-PGA)的制备方法，催化活性与生物分布，评价叶酸靶向的PGA联合前药对FR表达阳性肿瘤细胞的活性，为FDEPT的进一步研究提供理论基础和科学的实验依据，为肿瘤靶向治疗提供新思路。
一、Folate-PGA偶联酶的制备及其性质研究
通过双功能偶联剂EDC将叶酸与青霉素G酰化酶(PGA)偶联，产物经凝胶柱层析分离纯化；按BCA法测定偶联酶PGA的含量，利用叶酸在363nm处的特征吸收测定叶酸含量，计算叶酸与PGA的偶联比约为4∶1。
按PDAB法测定偶联酶活力，并考察叶酸偶联对PGA酶稳定性和催化活力动力学性质的影响。结果表明偶联酶的比活约为29.8U/mg，原酶为35U/mg，偶联酶保留了原酶85％以上的活力；原酶和偶联酶在5～8的pH范围内均较稳定。原酶和偶联酶作用的最适pH均为8.0；最适作用温度为55℃；偶联酶与原酶Km和Vmax值分别为4.92μmol/mL，3.28U/mL和4.71μmol/mL，3.37U/mL。
二、叶酸受体阳性肿瘤细胞对Folate-PGA偶联酶的特异性结合、摄取
利用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜以及放射性核素标记的Folate-PGA测定叶酸受体表达阳性FR(+)HeLa细胞与SKOV3细胞以及叶酸受体表达阴性FR(-)A549肿瘤细胞对Folate-PGA的结合与摄取，考察叶酸偶联的PGA酶对FR(+)肿瘤细胞的靶向性。
荧光显微镜下观察到FITC标记的Folate-PGA偶联酶与HeLa和SKOV3细胞于37℃培养4h后，细胞发出明亮的荧光，游离叶酸能阻断细胞对Folate-PGA偶联酶的特异性摄取；激光扫描共聚焦显微镜下观察，随着时间的延长，Folate-PGA偶联酶在HeLa细胞和SKOV3细胞中的摄取逐渐增加，荧光强度明显增强；Scatchard分析125I-Folate-PGA于4℃的细胞结合特性，结果表明125I-Folate-PGA与HeLa细胞特异性结合的亲和常数Ka为0.009L/pmol，平衡解离常数Kd为0.11nM，Bmax为5.34pM，每个细胞受体结合位点数为4.80×103个。125I-Folate-PGA与SKOV3细胞特异性结合的亲和常数Ka为0.004L/pmol，Kd为0.25nM，Bmax为11.35pM，每个细胞受体结合位点数为10.19×103个。
三、Folate-PGA偶联酶的药代动力学性质与生物学分布
采用125I标记法和TCA沉淀法研究Folate-PGA偶联酶在BALB/c小鼠的体内动力学性质；以人卵巢癌SKOV3裸鼠为模型，进行125I-Folate-PGA的体内生物分布和SPECT显像。结果表明：125I-Folate-PGA在BALB/c小鼠体内药代动力学行为符合二房室分布模型，125I-Folate-PGA和125I-PGA的分布相半衰期t1/2α分别为0.076士0.02h和0.068士0.086h，清除相半衰期分别为1.311士0.243h和1.336士0.322h，两组间t1/2α和t1/2β无显著性差异(P＞0.05)；125I-Folate-PGA与125I-PGA在卵巢癌裸鼠体内8h和24h的肿瘤摄取率存在显著性差异(P＜0.05)，摄取率分别为0.39±0.05，0.26±0.12％ID/g和0.30±0.01，0.12±0.07％ID/g。125I-Folate-PGA的肿瘤与正常组织(如心、脑、胰腺、肌肉)放射性摄取比值大于1；8h的SPECT显像显示125I-Folate-PGA在肿瘤部位有明显的放射性浓聚；而125I-PGA的肿瘤部位放射性与周围正常软骨组织影相当。
四、Folate-PGA联合N-苯乙酰化阿霉素对FR(+)HeLa和SKOV3细胞的毒性
HPLC法测定Folate-PGA偶联酶体外催化N-苯乙酰化阿霉素(DOXP)释放阿霉素的活性，结果表明偶联酶和原酶对DOXP的催化活性相似；以FR(+)HeLa和SKOV3细胞为模型细胞，运用FDEPT法，考察DOXP在Folate-PGA的特异性靶向作用下释放出活性阿霉素对细胞的毒性。结果表明：当PGA浓度为0.28μg/mL(0.01036U/mL)，DOXP联合Folate-PGA偶联酶使FR(+)HeLa和SKOV3细胞对阿霉素的敏感性显著增强，IC50分别由2.26μM降到0.72μM(P＜0.001)，2.45μM降到0.75μM(P＜0.001)，且这种特异性增强的细胞毒性在添加游离叶酸后完全翻转；而对于FR(-)A549细胞，DOXP合并Folate-PGA偶联酶的IC50(2.34μM)与DOXP合并未偶联叶酸的PGA的IC50(2.36μM)以及单独DOXP(IC50=2.04μM)没有显著性差异。
以上结果表明：①叶酸易与酶偶联，且叶酸修饰不会导致PGA催化活性的降低；②偶联比4∶1的Folate-PGA偶联酶能较好地实现对叶酸受体表达阳性肿瘤细胞的靶向输送；③Folate-PGA偶联酶血浆半衰期较短，24h内从循环中清除，并能特异性靶向至叶酸受体阳性肿瘤，保证了在给于前药之前不会因为Folate-PGA的非特异性结合而导致前药在非靶部位激活；④Folate-PGA的特异性靶向作用能提高阿霉素对FR(+)HeLa和SKOV3细胞的敏感性。