【摘 要】
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目的:先天性凝血因子X（FX）缺乏症是一种罕见的出血性疾病,发病率为百万分之一,由凝血因子X编码基因的突变引起,导致凝血因子X凝血活性异常和严重出血倾向。因此,识别凝血因子X中的突变对于先天性凝血因子X缺乏症的诊断和未来治疗至关重要。在一有频繁出血病史的先证者家系中发现了F10基因两种新突变c.794T＞C:p.Ile265Thr和c.865+5G＞A:IVS7+5G＞A两处突变,拟对突变对FX蛋
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目的:先天性凝血因子X（FX）缺乏症是一种罕见的出血性疾病,发病率为百万分之一,由凝血因子X编码基因的突变引起,导致凝血因子X凝血活性异常和严重出血倾向。因此,识别凝血因子X中的突变对于先天性凝血因子X缺乏症的诊断和未来治疗至关重要。在一有频繁出血病史的先证者家系中发现了F10基因两种新突变c.794T＞C:p.Ile265Thr和c.865+5G＞A:IVS7+5G＞A两处突变,拟对突变对FX蛋白表达及活性等功能特点展开研究,以揭示这两种突变在先天性FX缺乏症中的致病机制。方法:采集先证者病史及家系血样和唾液样本用于家系分析,提取DNA使用Sanger测序法分析突变位点,基于凝血酶原进行FX活性测定,ELISA法用于测定血浆FX含量,质粒构建、定点突变、细胞转染表达用于探究错义突变c.794T＞C:p.Ile265Thr是否影响FX的表达和分泌,突变蛋白纯化及FX多途径激活实验、凝血活性、凝血酶生成实验用于探究突变蛋白激活及促凝活性,异位转录和微基因构建用于探究剪切位点突变c.865+5G＞A:IVS7+5G＞A的剪切特征,危害性预测、保守性分析及分子动力学模拟用于分析突变可能的致病机制。结果:先证者家系的遗传分析确定了F10基因的两个单碱基取代变异,分别是位于催化结构域的c.794T＞C:p.Ile265Thr和剪切位点的c.865+5G＞A:IVS7+5G＞A。先证者凝血因子X活性和抗原水平分别为正常水平的1%以下和49.7%。活化的部分凝血活酶时间和凝血酶原时间分别延长至65.3秒和80.5秒。生物信息学分析预测这两种新变异具有致病性。错义突变c.794T＞C的体外表达研究显示该突变不影响凝血因子X正常的合成和分泌。蝰蛇蛇毒、凝血因子VII/组织因子和凝血因子VIII/凝血因子IX对凝血因子X的激活均显示突变体FX-Ile265Thr和正常对照之间没有明显激活差异。然而,活化的部分凝血活酶时间和凝血酶原时间测定的凝血活性以及凝血酶生成测定结果都表明,与正常对照相比,突变体FX-Ile265Thr的促凝活性降低。微基因检测显示剪切位点突变c.865+5G＞A:IVS7+5G＞A不导致剪切模式异常。结论:单独携带杂合变异c.794T＞C:p.Ile265Thr或c.865+5G＞A:IVS7+5G＞A表现出轻度FX缺乏,但两者复合杂合突变导致重度先天性FX缺乏。这两个突变的遗传分析可能有助于表征出血倾向并确认先天性FX缺乏症。体外表达和功能研究表明,突变体FX-Ile265Thr的低活性是由其酶活性降低而不是自身激活异常引起的。微基因检测帮助我们探索剪接位点突变可能的致病机制,尽管c.865+5G＞A突变微基因实验结果为阴性,但遗传分析和临床表型均提示该突变影响FX的表达,这可能提示了目前的微基因检测技术的局限性,未来需要进一步完善实验方法,更深入探究剪切位点突变以理解剪切方式的变化。
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