研究背景与目的:肺癌已成为一个重要的全球健康问题。仅2020年,全球新增患者220万,为全球第二大常见癌症和肿瘤致死的首要病因,严重威胁人类的生命安全。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是最常见的肺癌组织类型,占比约85%。近年来,随着新型治疗技术的不断研发并投入临床,NSCLC患者的生存质量得到有效改善,但由于快速进展和远处转移,患者的5年总体生存率仍不超过20%。因此,深入理解其进展规律,寻找更有效的诊疗策略是临床亟待解决的难题。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）是内源性蛋白质降解的主要方式,其中去泛素化酶（deubiquitinatingenzymes,DUBs）可对泛素化修饰进行修正,阻断依赖UPS的降解途径,维持蛋白质的稳定,其功能的异常在肿瘤进展中发挥重要调控作用。USP32作为泛素特异性蛋白酶（ubiquitin specific proteases,USPs）家族的新成员,在肿瘤中的功能日益受到关注,但目前关于USP32在NSCLC中的表达及作用分子机制尚未有研究阐明。因此,本课题以USP32与NSCLC为对象展开,主要分为三部分内容:第一部分:探究USP32在NSCLC中的表达情况,分析USP32与患者临床预后的相关性;第二部分:明确USP32在NSCLC细胞生长增殖、侵袭等恶性生物学行为中的作用;第三部分:探索USP32调控NSCLC进展的分子机制。本研究旨在明确USP32在NSCLC进展中的所扮演的角色,以期为寻找NSCLC未来诊疗的新靶点、新策略奠定相关理论基础。第一章USP32在NSCLC中高表达且与预后相关研究方法:1、通过 TCGA、Human Protein Atlas（HPA）、GEPIA2 等公共数据库分析USP32在NSCLC中的表达情况及与预后的相关性;2、采用Western blot检测USP32在NSCLC和多个肿瘤细胞系中的蛋白表达,免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测USP32在NSCLC细胞中的分布情况;3、应用免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）检测USP32 在 NSCLC 癌组织和癌旁组织中蛋白水平的差异,并对USP32的表达高低与NSCLC患者生存预后的关联进行进一步分析。结果:1、通过对TCGA数据分析后发现,USP32在NSCLC癌组织中表达升高;HPA数据库中的IHC样本显示USP32在NSCLC癌组织中明显表达;使用GEPIA2进行生存预测,分析提示USP32高表达的NSCLC患者OS/PFS（overall survival/disease free survival）均差于USP32低表达患者;2、USP32在NSCLC细胞中蛋白表达水平较正常肺上皮细胞升高,且USP32在多个肿瘤细胞系中均存在不同程度的表达;USP32在NSCLC细胞中主要分布于细胞膜与细胞质内;3、在组织水平上,IHC检测显示USP32在NSCLC癌组织中表达上调。Kaplan-Meier生存分析表明USP32高表达的NSCLC患者总生存期比低表达的患者明显更低,提示USP32的高表达与NSCLC患者预后不良密切相关。第二章USP32促进NSCLC细胞恶性生物行为研究方法:1、利用慢病毒转染构建稳定敲低USP32表达的NSCLC细胞系（A549/H1299）,通过CCK8、平板克隆形成、Transwell等细胞生物学功能实验检测下调USP32对NSCLC细胞的增殖、克隆形成、侵袭能力的影响;2、转染USP32过表达质粒构建稳定上调USP32的NSCLC细胞株,通过上述细胞功能学实验检测USP32过表达对NSCLC细胞的增殖、克隆形成、侵袭能力的影响;3、在构建稳定敲低/过表达的NSCLC细胞株后,通过皮下注射构建裸鼠异种移植瘤模型,体内观察下调/上调USP32对移植瘤生长速率、大小和体重的影响。结果:1、敲低USP32抑制NSCLC细胞的增殖活力和克隆形成能力,并对NSCLC细胞的侵袭性产生抑制;2、相反地,过表达USP32促进NSCLC细胞的增殖活力和克隆形成能力,促进NSCLC细胞的侵袭;3、通过裸鼠异种移植瘤模型发现,敲低USP32抑制NSCLC肿瘤在体内的生长,而过表达USP32则可明显促进瘤体在裸鼠体内的生长。第三章USP32调控Rap1蛋白促进NSCLC进展的机制研究研究方法:1、运用GEPIA2工具对USP32与Rap1蛋白的表达情况进行相关性分析,利用蛋白对接模拟USP32与Rap1蛋白的相互结合;2、通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,CO-IP）验证 USP32 与 Rap1的相互作用,进行IF实验检测USP32与Rap1在NSCLC细胞中的定位情况;3、在敲低USP32的细胞中,通过Western blot和qRT-PCR检测Rap1的表达变化,并使用MG132处理细胞,探究USP32是否通过调节蛋白酶体降解途径影响Rap1蛋白的水平;4、加入放线菌酮（CHX）处理敲低USP32的细胞,于不同时间点收取细胞蛋白样品,检测Rap1蛋白的半衰期变化,研究USP32对Rap1蛋白稳定性的影响;5、进行体内泛素化实验检测敲低USP32对Rap1泛素化水平的影响。在细胞中转染FLAG-Rap1过表达Rap1,检测对照组或敲低USP32细胞中Rap1泛素化水平的变化,进一步明确USP32对Rap1蛋白的去泛素化修饰作用;6、通过在对照或敲低USP32的NSCLC细胞中过表达Rap1进行功能回复实验,验证USP32是否通过Rap1调控NSCLC的恶性生物学行为。结果:1、GEPIA2分析提示USP32与Rap1的表达存在相关性,蛋白对接模拟表明USP32蛋白中的氨基酸可与Rap1蛋白的氨基酸形成氢键并相互结合;2、CO-IP检测证实USP32与Rap1存在相互作用;IF检测表明USP32与Rap1在细胞质中存在共定位;3、Western blot和qRT-PCR检测提示敲低USP32显著降低细胞中Rap1的蛋白水平,而对mRNA的水平无明显影响;蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞可逆转由USP32敲低而引起的Rap1蛋白水平降低;4、加入CHX处理细胞观察到USP32的敲低使Rap1蛋白半衰期明显缩短;5、体内泛素化实验表明USP32敲低可增加Rap1的泛素化水平;在细胞中过表达Rap1,进一步检测到Rap1泛素化修饰水平在USP32缺失的细胞中明显增加,证明USP32的存在可抑制Rap1的泛素化修饰;6、细胞功能回复实验表明,过表达Rap1增强NSCLC细胞的克隆形成和侵袭能力,USP32敲低的NSCLC细胞的克隆形成和侵袭性减弱,而Rap1的过表达可对USP32敲低细胞的克隆形成和侵袭能力有效恢复。全文结论:1、USP32在NSCLC中表达升高且与患者的预后相关,USP32促进NSCLC细胞的恶性生物学行为;2、USP32通过去泛素化修饰稳定Rap1蛋白,USP32调控Rap1促进NSCLC的恶性进展。