目的:蛋白磷酸酶2A （PP2A）可以在亮氨酸甲基转移酶1 （LCMT1）的催化作用下发生甲基化,在蛋白磷酸酶甲基酯酶1 （PPME1）的催化作用下发生去甲基化,这种可逆性的甲基化作用在调控细胞生长代谢和有丝分裂中具有重要作用。我们前期的研究发现细胞氧化应激可以引起PP2A甲基化状态发生改变,然而其中潜在的效应关系和调控机理尚不明确。本研究通过构建PPME1和LCMT1稳定高表达的细胞株,为后续从细胞和分子水平研究PP2A甲基化调控在细胞氧化应激中的作用提供有力的研究工具;并利用构建好的LCMT1高表达细胞株,探讨LCMT1高表达在细胞氧化应激中的作用及其机制。方法:1、构建PPME1及LCMT1高表达HEK293细胞株（1）以pcDNA3.0和pEGFP-N1为载体分别构建重组质粒PPME1-pcDNA3.0、PPME1-pEGFP-N1、LCMT1-pcDNA3.0 和 LCMT1-pEGFP-N1;采用脂质体转染法分别将这些重组质粒转染到HEK293细胞构建稳定高表达细胞株 PPME1-293、PPME1-GFP-293、LCMT1-293 和 LCMT1-GFP-293,并转染空载体做为对照组细胞株pcDNA3.0-293和pEGFP-N1-293。（2）采用荧光显微镜观察PPME1-GFP和LCMT1-GFP荧光融合蛋白的表达并计算转染效率;使用G418筛选阳性细胞;采用Q-PCR分析PPME1和LCMT1基因mRNA的表达;采用Western Blot检测PPME1 （或PPME1-GFP）和LCMT1 （或LCMT1-GFP）及去甲基化PP2Ac蛋白的表达。（3）采用激光共聚焦显微镜观察PPME1-GFP （或LCMT1-GFP）在细胞核和细胞质中的分布情况。2、研究LCMT1高表达在细胞氧化应激中的作用及其机制使用H₂O₂同时处理pcDNA3.0-293和LCMT1-293细胞诱导建立氧化应激模型,采用刃天青法检测两株细胞在模型中的细胞活性变化;采用JC-1染料试剂盒检测模型中两株细胞的线粒体膜电位变化;采用Western Blot分析模型中两株细胞去甲基化的PP2Ac、磷酸化的mTOR及其底物P70S6K1和4E-BP1等蛋白的表达情况;并使用PPME1特异性抑制剂AMZ-30和mTORC1通路特异性抑制剂Rapamycin对氧化应激模型进行处理以分析其中的分子调控机理。结果:1、PPME1及LCMT1高表达HEK293细胞株的构建（1）各细胞株PPME1或LCMT1蛋白的表达检测及其功能鉴定:PPME1-293 （或 PPME1-GFP-293）细胞内 PPME1 （或PPME1-GFP）蛋白的表达量明显高于对照组细胞pcDNA3.0-293 （或pEGFP-N1-293）,并且去甲基化PP2Ac蛋白的表达量也明显高于对照组细胞的表达（P < 0.05）,提示高表达的PPME （或PPME1-GFP）蛋白具有催化PP2Ac去甲基化的功能;LCMT1-293 （或 LCMT1-GFP-293）细胞内 LCMT1 （或 LCMT1-GFP）蛋白的表达量明显高于对照组细胞pcDNA3.0-293 （或pEGFP-N1-293）,而去甲基化PP2Ac蛋白的表达量低于对照组细胞的表达（P< 0.05）,提示高表达的LCMT1 （或LCMT1-GFP）蛋白具有催化PP2Ac甲基化的功能。（2） PPME1-GFP和LCMT1-GFP融合蛋白核质分布:PPME1-GFP融合蛋白主要分布在细胞核中,核质比约为2.5 : 1,与原生的PPME1在细胞内的分布一致;LCMT1-GFP融合蛋白在细胞核和细胞质中均有分布,核质比约为0.95 : 1,与原生的LCMT1在细胞内的分布一致。2、LCMT1高表达在细胞氧化应激中的作用及其机制研究（1） H₂O₂诱导PP2Ac去甲基化:H₂O₂可以诱导PP2Ac发生去甲基化,LCMT1高表达和PME-1抑制剂AMZ-30处理均能不同程度的抑制这种去甲基化作用。（2）LCMT1高表达拮抗H₂O₂对细胞的损伤作用:H₂O₂刺激对HEK293细胞的活性具有损伤作用,使用AMZ-30预处理细胞不影响这种损伤作用;而相同浓度H₂O₂作用下,LCMT1-293的细胞活性明显高于对照组细胞pcDNA3.0-293 （P < 0.05）,提示LCMT1高表达拮抗H₂O₂对细胞的损伤作用。（3） LCMT1高表达保护mTORC1信号通路的磷酸化作用:Rapamycin和H₂O₂处理HEK293细胞均可以明显抑制mTOR及其下游底物P70S6K1和4E-BP1的磷酸化作用;而相同浓度Rapamycin或H₂O₂作用下,LCMT1-293细胞内磷酸化蛋白P-mTOR,P-P70S6K1和P-4E-P1的表达水平要明显高于pcDNA3.0-293细胞的表达（P < 0.05）,提示LCMT1高表达保护mTORC1信号通路的磷酸化作用。（4） LCMT1高表达保护细胞线粒体膜电位:相同浓度H₂O₂作用下,LCMT1-293细胞线粒体膜电位的丧失程度明显小于对照组细胞pcDNA3.0-293的丧失程度（P<0.05）,提示LCMT1高表达保护细胞线粒体膜电位。结论:（1）本研究成功构建PPME1及LCMT1稳定高表达的HEK293细胞株（即PPME1-293和LCMT1-293）,以及带荧光标志GFP的PPME1及LCMT1稳定高表达的HEK293细胞株（即PPME1-GFP-293和LCMT1-GFP-293）。（2）在氧化应激条件下,LCMT1高表达可能通过调控PP2Ac甲基化保护mTOR及其下游底物P70S6K1和4E-BP1的磷酸化作用来保护细胞线粒体功能和细胞生存。