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背景:我国成年人糖尿病的患病率为11.6%,其中男性患病率12.1%,女性患病率11%,其中仅有25.8%的患者接受了治疗,然而接受治疗的患者中仅有39.7%的患者血糖得到良好的控制。目前对糖尿病的治疗方法有限,且效果均不够理想,尤其是1型糖尿病的治疗,仍需依靠终生的胰岛素注射。临床沿用的胰岛素替代治疗难以保持糖代谢的稳定,不能有效地阻止慢性血管病变的发展,且有发生低血糖的风险。胰腺移植虽能使患者重新获生理性调控血糖的能力,但手术所需技术难度高,手术创伤大,并发症凶险。而胰岛移植具有操作简单、手术侵袭损伤小等优点。自加拿大Edmonton抗免疫排斥方案的建立到美国宾夕法尼亚大学成功证实移植单供体来源的胰岛可达到外源性胰岛素脱离,临床胰岛移植取得了令人鼓舞的成绩。然而供胰短缺、胰岛移植物长期存活率低仍是阻碍胰岛移植发展的主要障碍。其中,移植免疫排斥、不良的再血管化与再神经化是影响胰岛移植物存活及功能的重要因素。生理条件下,胰岛同时受交感神经和副交感神经支配。其中交感神经通过收缩血管作用及激活胰岛β细胞β2受体抑制胰岛素释放。而副交感神经与胰岛β细胞形成突触结构,其释放的乙酰胆碱作用于胰岛β细胞的毒蕈碱M1、M3受体,增强其葡萄糖刺激胰岛素分泌功能。但动物胰岛移植模型表明,无论肝内、脾内还是肾被膜下,胰岛移植物的副交感神经密度均显著低于原位胰岛,而过度的交感神经再神经化会抑制胰岛功能,造成胰岛移植失败。本研究试图通过大鼠胰岛β细胞系INS-1及胆碱能NG108-15细胞的共培养模拟胰岛β细胞的副交感神经再神经化,通过系列实验验证胆碱能细胞可增强胰岛β细胞体内外功能表现,为胰岛β细胞替代治疗及胰岛移植领域提供了一个新观点,补充了一些新知识。方法:1.利用CCK-8细胞活力检测,优选最佳共培养基并研究共培养体系对INS-1细胞增殖的影响。2.利用慢病毒转染构建具有绿色荧光标记的INS-1细胞及具有红色荧光标记的NG108-15细胞。3.通过单层及三维共培养于体外模拟胰岛β细胞胆碱能神经再神经化。通过超低吸附培养板进行三维共培养。4.利用超敏大鼠胰岛素ELISA试剂盒检测各组细胞、假胰岛葡萄糖刺激胰岛素分泌功能。5.利用免疫荧光及Western-blot检测INS-1细胞及NG108-15细胞的E-钙黏素表达。6.利用抗体封闭实验研究E-钙黏素在杂合假胰岛形成过程中的作用。7.利用EdU试剂盒检测卡巴胆碱对INS-1细胞增殖的影响。8.利用链脲佐菌素（STZ）构建雌性裸鼠糖尿病模型。9.利用皮下注射进行假胰岛皮下移植。10.利用血糖监测及腹腔注射葡萄糖耐量试验（IPGTT）评价假胰岛移植物的功能。11.利用HE染色及免疫组化染色了解皮下杂合假胰岛移植物的分布情况。结果:1.HAT添加剂中的A（氨基蝶呤）对INS-1细胞具有较大毒性,影响其增殖;培养NG108-15细胞不能缺少H（次黄嘌呤）和T（胸腺嘧啶脱氧核苷）;含1×HT的INS-1培养基可满足INS-1细胞及NG108-15细胞的正常传代增殖。2.成功建立了具有绿色荧光标记的INS-1细胞及具有红色荧光标记的NG108-15细胞;在三维共培养条件下,INS-1细胞与NG108-15细胞可以相互粘附形成杂合假胰岛。3.卡巴胆碱可以显著提高INS-1细胞在20mM葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量,且不影响其在1.1mM葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量;单层培养时,共培养细胞在20mM葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量为单层INS-1细胞的1.24倍（p<0.0001）;在三维共培养时,杂合假胰岛在20mM葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量为纯合INS-1假胰岛的1.78倍（p<0.0001）;单层共培养和三维共培养均不影响INS-1细胞在1.1mM葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量;阿托品可以阻断共培养对葡萄糖刺激胰岛素分泌功能的增强效应;孤立的NG108-15细胞团并不增强INS-1假胰岛的葡萄糖刺激胰岛素分泌能力;三维结构不能提高INS-1细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能。4.INS-1细胞及NG108-15细胞均表达E-钙黏素,且三维培养可上调INS-1细胞及NG108-15细胞的E-钙黏素表达;封闭E-钙黏素影响杂合假胰岛的形成数量。5.卡巴胆碱不影响INS-1细胞的增殖;与NG108-15细胞共培养不影响INS-1细胞的增殖。6.皮下移植杂合假胰岛的糖尿病裸鼠恢复正常血糖水平（<11.1mmol/l）所需的时间更短（p<0.0001）。7.皮下移植杂合假胰岛的糖尿病裸鼠拥有更强的血糖清除能力（p<0.05）。8.杂合假胰岛移植物在皮下空间聚集成团而非弥散分布。结论:含1×HT的INS-1培养基适合用于INS-1和NG108-15细胞的短期共培养;INS-1细胞与NG108-15细胞在三维共培养条件下可以形成杂合假胰岛;INS-1细胞与NG108-15细胞共培养,特别是三维共培养,可以显著提升INS-1细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能;E-钙黏素是杂合假胰岛形成的关键因素之一;共培养不影响INS-1细胞的增殖;皮下移植杂合假胰岛可以使STZ诱导的糖尿病裸鼠恢复正常血糖水平所需的时间更短;皮下移植杂合假胰岛可以使STZ诱导的糖尿病裸鼠拥有更强的血糖清除能力。杂合假胰岛移植物在皮下空间聚集成团而非弥散分布。