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犬圆环病毒(Canine CV)属圆环病毒科圆环病毒属,是一种可引发犬出血性胃肠炎、坏死性血管炎、肉芽肿性炎症和淋巴坏死的新型哺乳类动物圆环病毒,严重危害犬科动物的健康。为了解我国Canine CV的流行动态和遗传多样性,本试验首先针对病毒Rep基因建立Canine CV SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,并对广西壮族自治区、广东省、四川省、重庆市、上海市、江苏省、山东省、吉林省、内蒙古自治区、北京市共1666份犬血清样品;其他犬科动物包括辽宁省37份狐狸粪便样品、13份貉粪便样品;广西壮族自治区共38份猫粪便样品进行检测,然后对Canine CV阳性样品DNA进行全基因组扩增,利用生物信息学软件进行同源性分析并构建系统进化树,对我国大陆地区Canine CV进行遗传进化分析。最后为深入研究Rep蛋白的功能,将Canine CV Rep基因克隆到原核表达载体p ET28a构建重组表达质粒,尝试对Rep蛋白进行原核表达。结果显示:试验建立的Canine CV SYBR GreenⅠreal-time PCR方法的Ct值与标准品在6.18×10~9～6.18×10~2copies/μL范围内呈良好的线性关系,其相关性为0.998,斜率为-3.671;检测敏感度为6.18×10~1copies/μL,且对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型、狂犬病病毒等均无特异性扩增;所有稀释度标准品模板均在86.45℃出现特异性熔解峰。以上结果表明本试验所建立的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法具有良好的敏感性和特异性,可以满足临床快速检测需要。对全国10个省市(自治区、直辖市)的犬血清样品以及其他犬科动物、猫粪便样品进行检测。结果显示:犬血清样品检测阳性率为5.82%(97/1666),并未在其他动物组织样品中检测到Canine CV。成功获得64个Canine CV中国流行毒株全基因组序列,毒株之间同源性为85.6%～100%,与71条参考毒株序列同源性为78.3%～100%,根据ORF2基因可分为Canine CV-1与Canine CV-2两个主要的基因型和8个基因亚型(1a、1b、1c、1d和2a、2b、2c、2d),其中2c和2d是本研究新发现的基因亚型。使用RDP4软件对病毒基因组进行重组分析,发现重组事件分布于整个Canine CV基因组中。成功构建原核表达载体质粒p ET-28a-Rep,将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,收集菌体蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳检测,可在35 Ku处检测到重组蛋白目的条带,可见其主要以包涵体形式表达。经Western blotting检测,Rep重组蛋白可以被一抗所识别,而对照组无特异性反应,表明Rep重组蛋白已获得正确表达。本试验成功建立了针对Canine CV Rep基因的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,实现对Canine CV快速、灵敏及准确的诊断。完成了我国10个省(市、自治区)Canine CV的分子流行病学调查和遗传进化分析,丰富Canine CV流行本地和遗传变异数据。另外,成功实现Canine CV Rep蛋白的原核表达,为新型血清学检测方法的建立及亚单位疫苗的研发奠定了基础。