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CRISPR/Cas系统是广泛分布于原核生物中的一种获得性免疫系统。作为引起结核病的病原菌,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的CRISPR/Cas系统属于Ⅲ-A类型CRISPR/Cas系统。研究发现,CRISPR/Cas系统蛋白在发挥抵御外源病毒或噬菌体入侵的同时,其组成蛋白还可以分泌到胞外并且对宿主细胞产生毒力,引起巨噬细胞凋亡等免疫反应。对于结核分枝杆菌CRISPR/Cas系统分泌蛋白引起宿主免疫细胞凋亡的现象,其信号通路的研究具有非常重要意义。 通过流式细胞仪进行细胞凋亡性实验的检测,发现CRISPR/Cas系统Cas6蛋白能够引起人巨噬细胞THP-1、小鼠成纤维细胞L929以及小鼠RAW264.7细胞发生凋亡,而DC2.4、BHK21等细胞不发生凋亡反应。荧光共聚焦实验发现,Cas6蛋白能够大量定位到THP-1细胞表面,且在细胞松弛素处理后,细胞不发生内吞的情况下,Cas6蛋白依然能够诱导THP-1细胞产生凋亡,说明膜表面蛋白在Cas6蛋白诱导细胞凋亡过程中扮演重要的作用。通过全蛋白质组芯片、免疫共沉淀等方法,得到了可能与Cas6相互作用的候选蛋白,随后通过SPR实验和Pull-down实验进一步确认CD84蛋白是能够与Cas6蛋白存在相互作用的膜蛋白之一。CD84抗体封闭实验导致了Cas6蛋白引起THP-1细胞凋亡能力降低,暗示了CD84可能直接参与了Cas6蛋白诱导细胞凋亡过程。 进一步检测发现,以上凋亡现象的发生伴随着细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的释放,但未发现IL-2、IL-10、IL-12等细胞因子的释放。用转录组测序的方法,并通过DAVID数据分析以及KEGG通路分析等生物信息学方法,确定了Cas6蛋白可能参与NFκB信号通路。最后,通过Western blot、qPCR等实验,证明了Cas6蛋白通过NFκB介导的信号通路引起免疫反应。 本课题,实验验证了膜蛋白CD84与Cas6蛋白有直接的相互作用,而且可能在Cas6蛋白诱导细胞凋亡路径中扮演重要作用。同时,实验发现Cas6蛋白也能够通过NF-κB介导的信号通路引起细胞免疫反应。研究工作为深入了解结核分枝杆菌的致病机理提供了坚实的基础,揭示了结核分枝杆菌分泌的毒力蛋白在免疫细胞及外周细胞中所发挥的新作用,为进一步研究结核分枝杆菌的致病机理提供了有效的依据。