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盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一,它极大的威胁着世界各国的农业生产。小盐芥(Thellugiella halophila)是拟南芥(Arabidopsis thaliana)的一个近缘属,属盐生植物,极端耐盐;另外,小盐芥的许多形态学特征及遗传学特征和模式植物拟南芥非常相似。因此,挖掘小盐芥中的耐盐基因成为人们研究植物耐盐机制的一个焦点。
本研究利用正向遗传学的方法,通过在拟南芥中功能性表达小盐芥cDNA文库,筛选出两个小盐芥耐盐基因((T)hellugiella(h)alophila(S)alt(T)olerance,ThST3和ThST305);之后又进一步利用反向遗传学方法,以ThST3的过表达转基因拟南芥为材料展开了ThST3耐盐机理的相关研究。
对ThST3过表达转基因拟南芥的耐盐性鉴定结果表明,在不同的幼苗发育时期包括种子萌发期及萌发后幼苗生长期,ThST3的过表达转基因株系都比对照耐盐。说明ThST3在转基因拟南芥中具有耐盐功能。另外,干旱处理实验和叶片失水实验表明,ThST3的过量表达株系比拟南芥野生型更耐旱。用多种逆境及逆境相关激素处理野生型小盐芥幼苗,经Northern Blot检测发现,ThST3的表达受NaC1、干旱、冷和热逆境及逆境相关激素ABA、JA、ACC和SA的不同程度的快速诱导,说明ThST3可能参与小盐芥对这些胁迫的早期应答反应。对pThST3∷GUS及pThST3∷ThST3-GUS的转基因拟南芥进行组织化学染色,结果显示ThST3在拟南芥中的表达模式具有一定的组织特异性:在拟南芥的根、茎、叶、花及荚的维管束中优势表达;在叶幼嫩组织、气孔及侧根中中强烈表达,但在主根中不表达。当有盐胁迫存在时,ThST3的组织表达模式有表现出新的特点。如NaC1和ABA会诱导ThST3在主根中表达,而且表达强度随时间延长而增强,暗示ThST3的组织特异性可能受到盐胁迫和ABA的调节。在ThST3的过表达转基因拟南芥中,分别在有无盐处理的条件下,对拟南芥中一些胁迫相关的Marker基因的表达进行了分析。在有盐和无盐条件下,RD22、ERD10、COR47、RAB18、RD29A、P5CS1、SOS1、SOS2及SOS3等胁迫相关的marker基因的表达模式与对照相比,都没有明显差异。结果表明ThST3的耐盐功能可能由一种新的调控机制所决定。
以35S启动子及ThST3内源启动子驱动的ThST3-GFP的转基因拟南芥为材料,对ThST3的亚细胞定位研究表明:融合蛋白ThST3-GFP主要分布于细胞核、细胞质和细胞膜;而在盐胁迫存在条件下,由ThST3内源启动子驱动的ThST3-GFP主要分布于细胞膜上,其在细胞核内的信号消失。这说明ThST3的亚细胞定位受盐胁迫调节。嫁接实验表明,ThST3的mRNA和蛋白都可以在拟南芥体内进行长距离移动,并且这种移动可以使嫁接嵌合体的野生型部分获得耐盐性。蛋白序列分析发现,ThST3与拟南芥一个C2 domain-containing protein高度同源,氨基酸序列同一性(identities)达89%,但此基因功能未知。通过对ThST3及其在其它物种中的同源蛋白进行聚类分析发现,ThST3在N端含有一个保守的可与Ca2+及膜脂重要成分结合的C2结构域。
以ThST3的过量表达株系和野生型拟南芥为材料,在进行盐胁迫处理的同时,补充不同浓度的Ca2+,结果发现:随Ca2+浓度升高,野生型拟南芥和ThST3的过量表达株系的耐盐性都随之增加,但ThST3的过量表达株系耐盐性增加的幅度明显大于野生型拟南芥;而在不加Ca2+的处理中,野生型拟南芥和ThST3的过量表达株系都表现为同样程度的盐敏感。
这些结果表明ThST3的耐盐功能受Ca2+调节,可能是由一种新的Ca2+依赖性调控机制所决定。