论文部分内容阅读
第一部分miR-17-5p在人结直肠癌中的表达及与临床资料的关系目的:检测miR-17-5p在人结直肠癌组织及癌旁正常组织、CRC细胞系中的表达水平,并分析miR-17-5p与结直肠癌患者临床病理特征之间的关系。方法:1.收集结直肠癌患者癌组织及对应的癌旁正常组织标本（距肿瘤组织边缘5 cm以上的结、直肠粘膜组织）,术后经病理证实所有癌均为结直肠腺癌或黏液腺癌,所有癌旁正常组织均为正常结直肠粘膜组织。2.TRIZOL法提取组织及细胞标本中的总RNA,反转录合成c DNA,通过实时荧光定量聚合酶链反应（real time quantitative reverse transcription-PCR,q RT-PCR）检测分析结直肠癌组织及癌旁正常组织、CRC细胞系标本中miR-17-5p的表达差异。3.采用统计软件SPSS 21.0对数据进行分析。两组之间比较使用Mann Whitney检验,其中P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.在47例临床组织样本中,结直肠癌组织中的miR-17-5p表达水平明显高于癌旁正常组织（P＜0.0001）。2.miR-17-5p在结直肠癌伴淋巴结转移的组织中的表达水平显著高于无淋巴结转移组织（P＜0.05）,表明其在结直肠癌组织中的表达与淋巴结转移有关;miR-17-5p的表达水平与患者的性别、年龄和肿瘤的位置、分化程度、浸润情况等均无明显关系（均P＞0.05）。3.在多数结直肠癌细胞系中miR-17-5p均有较高的表达水平（SW1116:P＜0.001;SW480,LOVO,HCT116:P＜0.0001）。结论:miR-17-5p在结直肠癌患者癌组织和人结直肠癌细胞系中的表达均显著上调,可能参与了结直肠癌的发生。第二部分miR-17-5p在人结直肠癌细胞系增殖、迁移和侵袭中的研究目的:研究miR-17-5p对人结直肠癌细胞系HCT116生物学行为的影响,探讨miR-17-5p在结直肠癌的发生发展过程中的作用机制。方法:1.利用Lipofectamine 2000在HCT116细胞中转染miR-17-5p模拟物（mimics）、抑制物（inhibitor）及各自对照（control）,构建miR-17-5p的过表达和敲低细胞模型,并通过q RT-PCR验证各自的转染效率。2.使用流式细胞术检测miR-17-5p过表达及敲低对结直肠癌细胞凋亡数量的影响。3.应用CCK-8试剂盒检测各组细胞的增殖状况,分别于24 h、48 h、72 h测定OD值,绘制增殖曲线,比较miR-17-5p过表达及敲低对结直肠癌细胞增殖能力的影响。4.利用集落形成实验,比较miR-17-5p过表达及敲低对结直肠癌细胞集落形成能力的影响。5.Transwell迁移实验检测上述各组细胞的迁移数量,分析miR-17-5p过表达及敲低对结直肠癌细胞迁移能力的影响。6.Transwell侵袭实验检测上述各组细胞的侵袭数量,探讨miR-17-5p过表达及敲低对结直肠癌细胞侵袭能力的影响。结果:1.构建过表达及敲低miR-17-5p的HCT116细胞系,均与对照组细胞系有统计学差异（P＜0.001）;2.与对照组相比,过表达miR-17-5p可抑制HCT116细胞的凋亡（P＜0.01）,促进细胞增殖、集落形成（P＜0.05）、迁移（P＜0.01）和侵袭能力（P＜0.05）,差异均有统计学意义;3.和对照组相比,敲低miR-17-5p可抑制HCT116细胞的增殖（48 h:P＜0.01,72 h:P＜0.001）、集落形成、迁移和侵袭能力（P＜0.05）,差异均有统计学意义。结论:miR-17-5p抑制结直肠癌细胞的凋亡,促进细胞的增殖、迁移和侵袭,在结直肠癌中发挥促癌作用。第三部分miR-17-5p在人结直肠癌中靶基因的筛选及验证目的:本部分研究旨在探索miR-17-5p在结直肠癌中发挥促癌作用的具体分子机制。方法:1.使用TRIZOL法提取过表达、敲低miR-17-5p及对照的HCT116细胞的总RNA,经过质控后通过Illumina Xten平台进行RNA测序（RNA-Seq）,分析差异表达基因（DEG）,结合信息分析网站分析miR-17-5p的潜在结合位点。2.采用qRT-PCR和双荧光素酶报告基因验证结直肠癌细胞中miR-17-5p对潜在靶基因HSPB2表达水平的调控作用。3.应用TRIZOL提取CRC组织标本中总RNA,反转录合成c DNA,最后通过q RT-PCR检测结直肠癌组织及癌旁正常组织标本中HSPB2的表达差异。4.利用TCGA和GEPIA数据库分析结直肠癌组织和正常大肠组织中HSPB2的表达差异。5.利用Lipofectamine 2000在HCT116和LOVO细胞中单独或共同转染miR-17-5p mimics和HSPB2过表达质粒,单独或共同转染miR-17-5p inhibitor和HSPB2敲低质粒,并通过q RT-PCR验证转染效率。6.应用CCK-8试剂盒检测各组细胞的增殖能力,分别于24 h、48 h、72 h测定OD值,绘制增殖曲线,分析miR-17-5p对HSPB2介导的结直肠癌细胞增殖能力的影响。7.采用集落形成实验分析miR-17-5p对HSPB2介导的结直肠癌细胞集落形成能力的影响。8.Transwell迁移实验检测上述各组细胞迁移能力,分析miR-17-5p对HSPB2介导的结直肠癌细胞迁移能力的影响。9.Transwell侵袭实验检测上述各组细胞侵袭能力,分析miR-17-5p对HSPB2介导的结直肠癌细胞侵袭能力的影响。结果:1.RNA-Seq结果显示受miR-17-5p过表达影响的m RNA共有647个,受miR-17-5p敲低影响的m RNA有419个,其中27个m RNA同时受到两者的影响,信息分析网站显示HSPB2与miR-17-5p具有潜在结合位点。2.在结直肠癌细胞HCT116和LOVO中发现HSPB2的表达水平及荧光活性受miR-17-5p的负性调节,表明HSPB2在CRC中是miR-17-5p的直接下游靶基因,差异均具有统计学意义。3.HSPB2在结直肠癌组织中的表达明显低于配对的癌旁正常组织（P＜0.0001）,TCGA（P＜0.001）和GEPIA数据库也显示HSPB2在结直肠癌组织中的表达明显低于正常结直肠组织。4.和对照组相比,miR-17-5p过表达显著促进了HCT116和LOVO细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力,而HSPB2过表达则显著抑制HCT116和LOVO细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力。此外,与单独过表达miR-17-5p的细胞相比,miR-17-5p和HSPB2的共同过表达使HCT116和LOVO细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力恢复到接近对照组细胞的水平,差异均具有统计学意义。5.和对照组相比,miR-17-5p敲低显著抑制了HCT116和LOVO细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力,而敲低HSPB2则显著促进了HCT116和LOVO细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力。更重要的是,与单独敲低miR-17-5p相比,miR-17-5p和HSPB2的共沉默使HCT116和LOVO细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力恢复到接近对照组细胞的水平,差异均具有统计学意义。结论:HSPB2抑制结直肠癌的发生,miR-17-5p通过负调控HSPB2促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。