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研究背景骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是最常见的关节病,可引起任何关节疼痛和功能障碍,其中包括颞下颌关节炎(Temporomandibular joint Osteoarthritis,TMJOA),膝关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA),OA疼痛严重影响患者的生活质量。OA最初被认为是一种以软骨病变为主的疾病,以往有大量的关节间隙狭窄(软骨损伤的影像学评估)与临床疼痛程度之间的相关性研究,然而这些研究最终产生了相矛盾的结果。OA疼痛是可以独立于软骨损伤而发生的。并且目前并没有很有效的方法来治愈OA疼痛。我们不仅要关注软骨损伤研究,还要更深入地了解慢性关节疼痛的发病机制,从而满足临床病人对提高生活质量的需求。OA关节内产生的炎性刺激物或炎症本身等有害刺激物首先激活伤害感受器(传入纤维的外周末端),进而可激活初级传入纤维,这些初级传入纤维的细胞体在神经节(Ganglion)中,进一步可导致神经节内神经元中某些基因表达的改变,或者是离子通道的改变,使神经元兴奋性增加、伤害性传入纤维将神经冲动从伤害性感受器的末端传导到中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中,并向大脑提供关于刺激的位置,强度和持续时间等信息。本文将从外周系统和中枢神经系统两个方面来系统阐述TMJOA和KOA这两种主要骨关节炎性疼痛发生发展和维持的机制,包括外周敏化和中枢敏化以及表观遗传学机制在这些炎性疼痛中的作用。TMJOA疼痛严重影响患者的生活质量,其治疗效果差,疼痛产生的具体分子机制尚不清楚。以往的研究表明,完全弗氏佐剂(Complete Freund’s adjuvant,CFA)颞下颌关节内注射可以导致TMJ组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及其受体显着增加。然而,目前尚不清楚TNF-α在三叉神经疼痛系统中是否参与TMJOA疼痛的发展。本实验利用CFA诱导的小鼠TMJOA炎性疼痛模型,首次发现TMJOA小鼠的三叉神经节(Trigeminal ganglia,TG)和三叉神经脊束核(Spinal trigeminal nucleus Caudalis,Sp5C)中TNF-α表达增高,在本论文的第一第二部分研究中聚焦于TNF-α参与TMJOA慢性疼痛发生发展的相关机制。KOA疼痛严重影响患者的生活质量,其疼痛的临床治疗效果差,疼痛产生的具体分子机制还不清楚。初级背根神经节(Dorsal Root Ganglion,DRG)是KOA疼痛传导通路的最初级感觉神经元,DRG中的NaV1.9是电压门控钠通道亚单位之一,在伤害性疼痛中起关键作用。然而,KOA疼痛模型的DRG神经元中NaV1.9表达是否增加仍然没有定论。本实验利用CFA诱导的大鼠KOA炎性疼痛模型,首次发现DRG中的蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)和NaV1.9表达增高,在本论文的第三四部分研究中,聚焦于PKC调控NaV 1.9参与KOA慢性疼痛发生发展的相关机制。研究目的本研究将阐明TMJOA和KOA引起的慢性炎性疼痛的行为学特征;揭示CFA诱导的TMJOA和KOA引起的疼痛传导相关神经元内相关分子表达增高,造成神经元兴奋性增加的分子基础;探讨表观遗传学在TMJOA和KOA慢性疼痛产生中的作用。以期从细胞-分子-核团-行为学的角度揭示TMJOA和KOA疼痛发生发展的机制。研究方法:第一部分:(1)TMJOA动物模型建立,疼痛行为检测在小鼠双侧颞下颌关节(TMJ)内注射CFA诱导TMJOA炎性疼痛模型。使用Von Frey丝测量三叉神经分布区域的机械疼痛阈值,用小鼠疼痛表情评分(Mouse Grimace Scale,MGS)以及用Dolognawmeter进行咬合力度评估,综合这三项进行疼痛行为测试。(2)TNF-α参与TMJOA疼痛产生的机制研究我们首先用Western blotting和免疫荧光染色方法,观察CFA注射对小鼠TG和Sp5C中TNF-α及其受体TNFR1的表达和分布的影响。使用C57BL/6野生型(WT)和TNF-α敲除(KO)小鼠,通过行为学测试验证缺失TNF-α的小鼠TMJOA疼痛阈值的大小。最后Sp5C内注射TNF-α拮抗剂R-7050,检测CFA-TMJ小鼠的疼痛阈值。第二部分(3)TNF-α启动子区域的DNA甲基化和去甲级化状态采用甲基化DNA免疫沉淀技术试验来探索三叉神经痛觉感受系统TG和Sp5C中TNF-α启动子区域的DNA甲基化和去甲级化状态。(4)去甲基化酶TET1参与调控TNF-α表达并参与TMJOA疼痛产生的机制研究用免疫印迹和免疫荧光观察小鼠TG和Sp5C中与表观遗传学相关的主要调控酶的表达变化。最后用shTET1-Lentiviral于TG内注射验证其在CFA-TMJ疼痛中的作用。第三部分(5)KOA动物模型建立,疼痛行为检测CFA注入大鼠膝关节建立慢性KOA炎性疼痛模型。使用Von Frey丝测量机械疼痛阈值,用HE染色确定KOA大鼠膝关节炎性特征。(6)PKC调控参NaV1.9表达并与KOA疼痛产生的机制研究通过免疫印迹和免疫荧光观察DRG中NaV1.9和PKC的表达。然后,我们在体外培养的DRGs神经元中使用PKC抑制剂(GF-109203X)和激活剂(PMA),通过RT-PCR观察它们对NaV1.9表达的影响。还通过免疫荧光法观察对大鼠鞘内注射GF-109203X和PMA对在体的L4-6 DRG神经元中NaV1.9表达的影响。同时,我们测试了 PKC抑制剂和激活剂给药前后对大鼠热,冷和机械阈值的伤害性行为反应阈值的影响。第四部分(7)长链非编码RNA参与KOA疼痛产生的机制研究KOA研究中,我们继续探索遗表观传学调控是否参与KOA疼痛的传导,首先将CFA或生理盐水注入大鼠膝关节建立慢性KOA炎性疼痛模型,第七天,取两组大鼠L4-6DRG神经元与大鼠lncRNA芯片杂交,洗涤,固定并扫描,获得芯片图,并读值,得到原始数据。使用GeneSpring GX v12.1软件(Agilent Technologies)对原始数据进行Quantile标准化和随后的数据处理。获得两组样品间具有统计学意义的差异表达lncRNA或差异表达mRNA,我们用QPCR验证了变化最大的一些lncRNAs,并做关联性分析。研究结果第一部分1.TMJOA研究中CFA(10μl)诱导WT小鼠的TMJOA炎性疼痛,于CFA后第1天开始并持续至少10天。2.注射CFA后,WT小鼠的TG和Sp5C中的TNF-α均上调。CFA诱导的TMJOA疼痛行为在TNF-α KO小鼠中被显着抑制。免疫荧光染色显示,CFA注射不仅可以增强TG和Sp5C中TNF-α与Ibal(小胶质细胞标志物)的共定位,还可以诱导Sp5C神经元中TNF-α的过表达。Sp5C内注射TNF-α拮抗剂可以降低CFA-TMJ注射引起的疼痛超敏。第二部分3.TMJOA研究中通过DNA dot-bolt试验我们发现CFA-TMJ并没有改变全基因组DNA的5mc和5hmc的表达水平,但是DNA甲基化免疫沉淀分析证明,CFA注射后TG中TNF-α启动子区域的DNA甲基化明显减少,DNA去甲基化明显增多,Sp5C中TNF-α启动子区域的DNA甲基化无明显变化。4.进一步探讨发现CFA-TMJ并没有改变去甲基化酶DNMT1,3A,3B,以及组蛋白去乙酰化酶HDAC1,3的表达,但是CFA注射后TG中去甲基化酶TET1增高。免疫荧光染色显示,TET1与Neun(神经元细胞标记物)共标,不与Ibal和GFAP(星形胶质细胞标记物)共标。shTET1于TG内注射可减轻小鼠CFA-TMJOA 疼痛。第三部分5.KOA研究中结果显示,与Sham组相比,CFA-KOA组大鼠的机械,热,冷刺激足退缩阈值降低。6.KOA大鼠的DRG中NaV1.9和PKC表达增加。Nav1.9和PKC α的蛋白质以及mRNA表达平行增加。免疫荧光实验发现,Nav1.9在KOA大鼠中优先与IB4+小神经元共定位。在培养的DRG神经元中,PMA增加了Nav1.9表达,而GF-109203X阻止了 PMA的作用。PMA可提高无处理大鼠的Nav1.9表达,而GF-109203X可降低KOA大鼠的Nav1.9表达。PMA可造成无处理大鼠的机械性和冷痛觉过敏。而GF-109203X减弱了 KOA疼痛模型中的机械和冷痛觉过敏。第四部分7.KOA研究中我们详细分析lncRNAs在模型组和对照组DRGs的表达变化以及其对疼痛相关基因表达变化的调空作用。与生理盐水组相比,CFA注入大鼠膝关节建立慢性KOA疼痛模型有181个lncRNAs以及275个mRNAs有显著的差异性表达变。我们用QPCR验证了变化最大的一些lncRNAs,并通过Go Pathway分析得出与钠离子通道相关联的lncRNAs,证明KOA导致的钠离子通道相蛋白的增加与lncRNAs的差异性表达可能相关,需要进一步验证。研究结论1.TNF-α在CFA诱导的TMJOA炎性疼痛的三叉神经痛觉传导系统TG和Sp5C中起关键作用,增加的TET1使小鼠TG中TNF-α启动子区域去甲基化增多并激活TNF-α基因转录,使TNF-α表达增高,最终导致CFA-TMJ炎性疼痛。2.PKC在CFA诱导的KOA炎症疼痛Nav1.9上调中的伤害感受通路中发挥重要作用。大鼠芯片测试的差异性表达的lncRNAs可能是诊断或治疗KOA的新的生物标志物和新型治疗靶点。