安宫牛黄丸是中医传统的“瘟病三宝”之一,具有清热解毒、镇惊开窍的功效,主治瘟病高热、神昏、中风、口眼歪斜、筋脉牵引、痰痫壅盛等证。临床实践证明,安宫牛黄丸对各种原因所致的脑功能障碍及昏迷,都具有确切的促进清醒作用。但由于组方中朱砂、雄黄含有HgS和As2S2,且近年来关于安宫牛黄丸引起汞毒性肾病等临床毒副作用的报道不断出现,使人们对安宫牛黄丸使用的安全性及朱砂、雄黄在方中存在的合理性提出质疑。因此,朱砂、雄黄在安宫牛黄丸不同药理作用中存在的意义成为关注的焦点。已有研究表明,安宫牛黄丸对脑细胞有明显的保护作用,并提出其脑保护作用即可能是安宫牛黄丸开窍醒脑作用的主要机制之一。含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸可增加皮层神经元c-fos的表达,对皮层神经元有直接的激活作用,而去朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对皮层神经元的活化作用明显减弱。这些资料提示,朱砂、雄黄可能在安宫牛黄丸改善脑损伤中发挥一定作用。对朱砂、雄黄在安宫牛黄丸改善脑损伤、促清醒中的作用及机制进行深入研究,可为朱砂、雄黄在方中存在的合理性提供实验依据。2006年北京市科委立专项课题(课题编号:H040230130710),探讨安宫牛黄的安全范围及朱砂、雄黄在安宫牛黄丸中存在的必要性。本研究作为北京市科委研究专项的一部分,主要采用大鼠内毒素脑损伤和缺血性脑损伤两种模型,观察含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对不同脑损伤大鼠脑电图的影响。采用放射性配体结合法、免疫组织化学(IHC)、分子生物学等方法,观察含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对脑损伤胆碱、单胺类递质功能及突触超微结构的影响,同时观察了方中等量朱砂+雄黄、雄黄、朱砂的作用,探讨含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对脑损伤的改善作用,并分析朱砂、雄黄在其中存在的意义。1含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对脑损伤大鼠脑电图的影响脑电图(EEG)作为一种自发电活动,是脑功能变化的客观指标,和大脑皮层的活动水平密切相关。意识状态的变化和EEG改变存在密切的关系,改善机体的意识状态,同时伴有EEG的激活。EEG在睡眠向觉醒过渡过程中的转化,称为EEG激活,激活时慢波被抑制快波节律增加,即主要表现β波增加。EEG激活是觉醒的标志,也是大脑皮层活动增强的标志。在哺乳动物的新皮层EEG激活反映了行为唤醒状态。δ波是频率在0.5～3Hz之间的慢波,各种脑损伤意识障碍时EEG的典型特征是皮层广泛的δ波出现。抑制脑损伤δ波活动、增加β波活动、激活脑电图可能是安宫牛黄丸改善脑损伤、促进清醒的重要标志。实验以大鼠缺血性脑损伤、内毒素脑损伤为模型,观察了含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对大鼠脑损伤脑电图β波、δ波功率和相对功率的作用。1.1对缺血性脑损伤大鼠皮层EEG的影响将预先放置皮层永久电极的SD大鼠随机分为6组:假手术组,模型组,含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸(全方)高剂量组(0.4g/kg)、低剂量组(0.2g/kg),不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸(简方)高剂量组(0.32g/kg)、低剂量组(0.16g/kg)。假手术组及模型组分别灌胃等容量的蒸馏水,连续给药3天后,末次给药后1h,采用MCAO法复制大鼠脑缺血模型,缺血后即刻描记大鼠左右额顶叶皮层EEG。结果显示,造模后大鼠双侧额顶叶皮层脑电图β波的功率及相对功率均降低,δ波功率降低,而相对功率增加,和对照组比较,均P<0.05。全方可使缺血侧β波相对功率提高;简方作用不明显。简方和全方均可提高未缺血侧δ波功率。1.2对LPS脑损伤大鼠皮层EEG的影响将预先放置皮层永久电极的SD大鼠随机分为9组:对照组,模型组,全方高剂量(0.4g/kg),全方低剂量组(0.2g/kg),简方高剂量组(0.32g/kg),简方低剂量组(0.16g/kg),朱砂+雄黄组(0.08g/kg),雄黄组(0.04g/kg),朱砂组(0.04g/kg)。按上述剂量连续给药3天,末次给药后1h,采用LPS 16mg/kg尾静脉注射复制内毒素脑损伤模型,连续描记LPS注射后1h、2h、4h、6h大鼠额顶叶皮层EEG的变化,并观察药物对内毒素脑损伤6h后皮层EEG的影响。结果显示,内毒素可引起大鼠皮层EEGβ波功率和相对功率持续降低,δ波相对功率升高,即表现脑电图的快活动(主要β波)减弱,慢活动(主要δ波)增强,且以内毒素注射后6h变化最显著,和对照组比较,P<0.05。全方可提高β波功率和相对功率,和模型组比,P<0.05;简方对β波功率的作用明显减弱,简方低剂量和全方比较差异显著,P<0.05,简方高剂量可以提高β波相对功率;朱砂+雄黄、雄黄可提高β波功率和相对功率。全方、简方、朱砂、雄黄均可抑制内毒素脑损伤6h脑电图δ波相对功率,组间差异不显著。小结:缺血性及内毒素性脑损伤脑电图的主要变化是:β波功率及相对功率明显降低,δ波相对功率明显提高,δ波功率降低或变化不明显。各组药物对δ波作用相同,但对β波的作用不同。全方可提高两种脑损伤β波功率及相对功率(和模型比,P<0.05);简方对β波作用弱,其中对LPS脑损伤β波功率作用和全方比,P<0.05,简方高剂量可提高β波相对功率,和模型比,P<0.05;朱砂+雄黄、雄黄、朱砂和全方的作用一致,也可使β波功率及相对功率提高,上述结果提示,朱砂、雄黄可能参与了安宫牛黄丸对脑损伤脑电图的激活作用。2含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤大鼠皮层、脑干胆碱系统的影响乙酰胆碱(Ach)是脑内主要的兴奋性神经递质,Ach通路的高功能状态对保持机体的觉醒状态具有重要作用,也是脑电图激活的直接通路之一。胆碱乙酰转移酶(ChAT)是Ach合成的唯一限速酶,可作为胆碱能神经活性的标志。乙酰胆碱酯酶(ChE)是Ach的代谢酶,主要调节脑内Ach的含量。M-R是G-蛋白偶联受体,Ach通过作用于M-R激活皮质,促进觉醒。实验将SD大鼠随机分7组:对照组,模型组,全方组(0.4g/kg),简方组(0.32g/kg),朱砂+雄黄组(0.08g/kg),雄黄组(0.04g/kg),朱砂组(0.04g/kg)。采用生化法、放射性配体结合法、免疫组化及分子生物学的方法,观察含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤6h大鼠皮层及脑干ChAT含量、ChE的活性、ChAT及ChATmRNA表达、Ach的含量、M-R的亲和力、G-蛋白的影响。观察含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对脑损伤中枢胆碱系统功能的影响及朱砂、雄黄在其中发挥的作用。2.1对LPS致脑损伤大鼠皮层及脑干Ach含量的影响采用碱性羟胺比色法测定皮层和脑干中Ach的含量,结果显示,LPS尾静脉注射后6h,大鼠皮层Ach含量变化不明显,但脑干Ach含量明显降低。全方可明显增加脑干Ach含量,和模型组比较,P<0.05;简方对脑干Ach含量作用不明显;朱砂+雄黄、朱砂、雄黄亦无明显作用。2.2对LPS致脑损伤大鼠皮层及脑干ChAT和ChE的影响静脉注射LPS后,可见皮层及脑干ChAT含量增加,ChE变化不明显。全方降低皮层及脑干ChAT含量,和模型组比较,P<0.05;简方对皮层及脑干ChAT含量增加均无明显影响,和全方比较,P<0.05;朱砂+雄黄、雄黄降低皮层ChAT含量的作用和全方相同。朱砂则使脑干ChAT含量降低。2.3对LPS脑损伤大鼠皮质不同区ChAT及ChATmRNA表达的影响免疫组化结果显示,脑内ChAT的表达主要集中在海马,在海马的4个区都有大量表达,皮层也有少量表达。LPS注射后,皮质第3层、海马CA1、海马CA3区的ChAT的表达均增加。全方可抑制3个部位ChAT的表达增加,和模型组比,P<0.05;而简方对ChAT表达无明显抑制作用,和全方比较,P<0.05;朱砂+雄黄、雄黄和全方相同,可以使ChAT在皮层和海马的表达减少。ChATmRNA检测结果显示,组间无明显差异。2.4对LPS脑损伤大鼠脑皮层及脑干M-R亲和力的影响采用放射性配体结合法测定皮层及脑干M-R亲和力。结果显示,LPS尾静脉注射6h后,皮层中M-R的亲和力降低,脑干中M-R亲和力提高。全方可使皮层M-R的亲和力增加;而简方对M-R亲和力无明显影响,和全方比较,P<0.05;朱砂+雄黄和全方相同,可使皮层M-R亲和力增加。2.5对LPS脑损伤大鼠皮层及脑干G-Protein含量的影响G-蛋白是细胞外信息进入细胞的门户,是M受体信号转导的重要组成部分。G-蛋白主要有两类:兴奋性G-蛋白(Gs),可激活腺苷酸环化酶(AC)使cAMP增加;抑制性G-蛋白(Gi),抑制AC,使cAMP减少,正常的Gsα/Giα比例是维持正常细胞功能的基础。LPS使皮层及脑干Gsα减少,而Giα含量增加,Gsα/Giα比值降低。全方通过增加Gsα含量,使Gsα/Giα比值提高;简方无增加Gsα含量的作用,可轻度降低Giα含量,提高Gsα/Giα比值;朱砂+雄黄、雄黄增加Gsα含量,提高Gsα/Giα比值作用,和全方一致。小结:LPS可损伤皮层及脑干胆碱系统,引起脑干Ach含量降低,皮层及脑干ChAT含量升高,皮层M-R亲和力降低,脑干M-R亲和力提高,皮层及脑干Gsα/Giα比值下降。全方可提高脑干Ach含量、降低皮层及脑干ChAT含量,提高皮层M-R亲和力,增加Gsα含量,上调Gsα/Giα比值,从而拮抗LPS引起的中枢胆碱系统功能的损伤;简方对LPS引起的皮层及脑干M-R亲和力、ChAT含量的变化无明显改善作用;朱砂+雄黄、雄黄在对皮层ChAT含量、G-蛋白含量、M-R亲和力的作用上和全方一致。因此,朱砂、雄黄在全方改善LPS引起胆碱能系统功能损伤中发挥作用,其中雄黄的作用更明显。3含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤大鼠皮层、脑干单胺系统的影响参与中枢兴奋性调节的单胺类递质主要包括:NE,5-HT,DA。NE,DA主要参与脑电和行为觉醒的维持,5-HT和Ach一起被称为皮层激活的直接通路,可见,单胺类递质参与中枢神经系统觉醒的维持。但脑内单胺类递质异常增多也可导致脑损伤。NE,DA,5-TH可能成为安宫牛黄丸改善脑损伤、促清醒作用的重要方面。本实验采用HPLC-ECD检测法,测定了大鼠尾静脉注射LPS 6h后皮层和脑干儿茶酚胺类及其代谢产物的含量变化。并对皮层及脑干MAO活性及皮层TH、THmRNA表达进行测定,观察含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤单胺递质系统的影响及朱砂、雄黄在其中的作用。实验分组、给药方法及造模方法同前。3.1对LPS脑损伤大鼠皮层、脑干单胺类递质及代谢产物含量的影响LPS注射后6h,可见皮层中NE、5-HT及代谢产物5-HIAA含量明显升高;DOPAC的含量降低,即主要表现为NE、5-HT两类递质的紊乱。全方有降低NE含量、增加DOPAC含量的趋势,且明显降低5-HIAA含量,和模型组比较,P<0.05;简方对皮层NE含量增加改善作用不明显,和模型组及全方组比较,P<0.05,也可使皮层DA含量显著升高,和其他各给药组比较,均有显著差异;单用朱砂、雄黄和全方相同,可降低NE含量,和模型组比较,P<0.05。LPS注射后,同样引起脑干NE、5-HT递质功能紊乱,即NE、5-HT、5-HIAA含量升高。全方可明显降低NE含量;简方对NE含量无影响;单用朱砂、雄黄可显著降低NE含量,和模型组比较,P<0.05。3.2对LPS脑损伤大鼠皮层、脑干单胺类递质TH及MAO的影响LPS及各组药物对大鼠皮层TH、THmRNA表达均无明显影响,皮层MAO活力略有降低,脑干MAO的活力略增加。全方和简方对LPS引起的皮层及脑干MAO的变化均显示一定的复衡作用。小结:LPS可导致NE、5-HT、5-HIAA在皮层及脑干大量增加,皮层MAO活力降低,脑干MAO的活力增加,引起NE、5-HT递质功能紊乱,致脑损伤。全方抑制皮层及脑干NE的增加,改善5-HT的代谢,并对LPS引起的MAO活性改变有轻度复衡作用;简方对皮层及脑干NE的增加无明显影响,并可增加皮层DA含量;而单用朱砂、雄黄可抑制皮层及脑干NE增加。朱砂、雄黄对NE的影响和全方的一致性,提示朱砂、雄黄在全方改善脑损伤单胺类递质紊乱中发挥作用。4含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤大鼠皮层锥体细胞形态及突触超微结构的影响神经元是中枢神经系统的基本结构和功能单位,神经元形态的正常是脑功能正常的基础,缺血及内毒素均可导致神经元的损伤,引起神经元功能的缺失。突触作为神经元之间相接触部分的特化区,是神经元实现生理功能的关键性部位,对保持脑功能的正常起非常重要的作用。本实验采用光学显微镜、透射电子显微镜对LPS脑损伤大鼠皮层锥体细胞形态及突触超微结构进行观察,并对突触结构参数进行计量统计。探讨安宫牛黄丸改善脑损伤的结构基础,及朱砂、雄黄在其中的作用。4.1对LPS脑损伤大鼠皮层锥体细胞形态的影响LPS可引起明显的组织水肿,大量的神经元胞体缩小,核固缩,部分固缩呈三角形,多数细胞核仁消失,胞浆红染。全方可使组织水肿减轻,锥体细胞胞体缩小及核固缩减轻,多数细胞核仁清晰,胞浆均质淡染;简方组组织水肿减轻,但仍可见较多的锥体细胞胞体缩小,核仁消失,并有明显的核固缩,胞浆染色深;朱砂+雄黄、雄黄组锥体细胞胞体缩小、核固缩减轻,核仁清晰,胞浆染色浅淡,朱砂组锥体细胞形态也有改善。4.2对LPS脑损伤大鼠皮层突触结构的影响透射电镜的结果显示,LPS可导致皮层突触数量减少,突触前、后膜融合,突触间隙模糊不清,突触后膜PSD明显减少,突触前膜大量囊泡聚集。全方组皮层镜下多见保存完好的突触结构和大的笑型突触,前膜附近无明显的囊泡聚集,突触后膜PSD保持较好;简方组突触结构保存尚好,但突触前膜囊泡大量聚集现象明显,突触后膜PSD有一定改善;朱砂+雄黄组、雄黄组、朱砂组大鼠皮层突触超微结构变化相似:突触结构清晰,突触前膜囊泡聚集较少,甚至少于正常组,突触后膜电子致密体保存较好,在镜下偶见大的突触结构。定量统计结果显示,LPS脑损伤皮层突触数量、PSD的厚度和长度明显减少,突触间隙轻度缩窄。除突触数量外,全方对上述指标均有明显的改善作用;简方可增加皮层突触数量和PSD的厚度,在对突触间隙及PSD厚度的影响上,全方和简方差异显著,P<0.05;朱砂+雄黄可增加突触数量、PSD的厚度,并使突触间隙增加,和全方一致。小结:安宫牛黄丸可显著改善LPS引起的皮层锥体细胞的损伤,改善突触结构的破坏及突触前膜囊泡聚集,对PSD的保护作用明显;简方可以增加突触的数量,对PSD也有一定的保护作用,但对突触间隙改善作用不明显,和全方比差异显著,对突触前膜的囊泡聚集无明显作用;朱砂+雄黄可增加PSD的厚度、改善突触间隙的缩窄,和全方的作用相似,同时改善突触前膜囊泡聚集作用明显。可见,全方在保护皮层神经元形态的正常,改善LPS引起的突触结构的损伤方面优于简方,在改善突触前膜囊泡聚集中朱砂、雄黄显示更明显的作用。5含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤大鼠皮层、脑干ATP及SynapsinⅠ的影响递质释放是影响神经递质功能的因素之一,可能成为安宫牛黄丸改善胆碱及单胺类递质功能紊乱,改善脑损伤的重要方面。影响神经递质释放的因素很多,其中SynapsinⅠ调节神经递质释放的动力学过程;Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶则通过维持神经细胞静息膜电位和细胞内钙的低稳态来影响递质释放。本实验主要观察含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对LPS脑损伤ATP酶及SynapsinⅠ的影响,初步探讨安宫牛黄丸对中枢神经递质释放的作用及朱砂、雄黄对其影响。5.1对LPS脑损伤大鼠皮层SynapsinⅠ及其mRNA表达的影响LPS注射后,海马DG区SynapsinⅠ明显较少。全方可使SynapsinⅠ表达明显增加,简方作用不明显,和全方组比较,P<0.05。朱砂+雄黄、朱砂可使SynapsinⅠ增加,其中朱砂作用明显,和模型比较,P<0.05。朱砂可使皮层SynapsinⅠm RNA表达增加,优于其他各给药组。5.2对LPS脑损伤大鼠皮层及脑干ATP酶活性的影响尾静脉注射LPS可使皮层及脑干Na+-K+-ATP酶活性、皮层Ca2+-ATP酶活性轻度降低。全方可使皮层及脑干Na+-K+-ATP酶活性升高,简方仅能升高脑干Na+-K+-ATP酶活性,全方和简方均不影响Ca2+-ATP酶活性。雄黄可使脑干Na+-K+-ATP酶活性升高。小结:全方可提高LPS注射后皮层及脑干Na+-K+-ATP酶活性,增加SynapsinⅠ表达;简方仅提高LPS脑损伤脑干Na+-K+-ATP酶活性,对皮层SynapsinⅠ的改善作用不明显,和全方比较,P<0.05;雄黄可使脑干Na+-K+-ATP酶活性升高,朱砂则可增加DG区SynapsinⅠ的表达。全方和简方、朱砂、雄黄比较,具有明显的优势,对LPS所引起的ATP及SynapsinⅠ改变有更全面的复衡作用,朱砂在全方增加SynapsinⅠ表达中发挥作用。结论:本研究分别以缺血及内毒素性脑损伤大鼠为观察对象,应用电生理学方法、生化法、放射性配体结合法、HPLC-ECD法及分子生物学的方法,观察了含与不含朱砂雄黄的安宫牛黄丸对脑损伤脑电图、胆碱及单胺类递质系统的功能、皮层锥体细胞的形态及突触超微结构、ATP活性和SynapsinⅠ表达等的影响。结果显示,缺血性及内毒素脑损伤可引起大鼠脑电图β波功率及相对功率明显降低,δ波相对功率明显提高,脑电图慢化。胆碱、单胺递质的紊乱及神经元和突触结构的损伤可能是LPS引起的脑电图慢化、脑功能降低的机制。全方可提高不同脑损伤脑电图β波功率及相对功率,而抑制δ波相对功率,发挥明显的脑电激活作用;提高LPS脑损伤脑干Ach含量、降低皮层及脑干ChAT含量,提高皮层M-R亲和力,增加Gsα含量,上调Gsα/Giα比值,拮抗LPS引起的胆碱系统功能损伤;抑制LPS引起的皮层及脑干NE的增加,改善5-HT的代谢,改善中枢单胺类递质的功能;显著改善LPS所致皮层锥体细胞形态损伤,改善突触结构的破坏,保护突触后膜PSD;提高LPS注射后Na+-K+-ATP酶活性,增加SynapsinⅠ表达。可见,安宫牛黄丸通过改善皮层及脑干乙酰胆碱及单胺类递质的功能,保护损伤造成的皮层神经元形态和突触结构的破坏,从而发挥激活脑电图、改善脑功能、促进清醒作用。简方在对脑损伤脑电图激活、ChAT含量、M-R亲和力、NE含量、DA含量、突触间隙、PSD的厚度、SynapsinⅠ表达等方面的影响上,和全方差异显著。而朱砂、雄黄在上述几个方面和全方表现相似或相同的作用,因此,朱砂、雄黄与安宫牛黄丸改善胆碱及单胺类递质的功能,保护神经元形态及突触超微结构等作用机制密切相关,在安宫牛黄丸改善脑损伤、促清醒中发挥积极作用。本课题的创新点:1论文采用电生理的方法,通过观察含与不含朱砂、雄黄安宫牛黄丸对脑损伤大鼠皮层脑电图的激活作用,明确了安宫牛黄丸改善大鼠实验性脑损伤脑功能、促清醒的作用,首次报道了朱砂、雄黄的存在与否对安宫牛黄丸改善脑功能的影响。2通过对含与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸及朱砂、雄黄改善脑损伤作用机制的研究,证明了朱砂、雄黄与安宫牛黄丸改善脑损伤胆碱及单胺类递质的功能密切相关。