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在细胞色素P450酶系中，CYP1～4亚家族在动物肝脏代谢外源性药物的过程中发挥了重要作用，它的活性变化可能对食品动物的药物残留产生重要影响。然而，目前关于食品动物肝CYP450的研究还很有限，水产用药对鱼类CYP450影响的研究更为匮乏，特别是在我国传统的淡水养殖鱼类——鲫鱼，其肝CYP450的相关研究几乎为零。因此本文以鲫鱼为靶动物第一次系统研究了生理情况与环境因素对其CYP450的活性与表达的影响，同时鉴于目前关于常用水产用药对鱼类CYP450影响的研究基本处于空白，本文进一步选择了六种常用药物:阿奇霉素、伊维菌素、氟苯尼考、诺氟沙星、左旋咪唑和头孢曲松，研究它们对鲫鱼CYP450的影响及作用机制，一定程度上填补了国内外鱼类CYP450的研究空白。
1.鲫鱼CYP450基因的克隆和内参基因的筛选。为了能全面深入地研究CYP450在鲫鱼药物代谢功能中的重要作用，我们首先从基因水平上检测CYP450的表达规律。目前关于鲫鱼CYP450基因的研究资料还非常匮乏，为了能够得到鲫鱼CYP450酶系准确、可靠的基因表达量变化，本章先克隆了鲫鱼CYP3A、CYP4T和CYP3A受体PXR的部分序列，并与其他物种进行了同源性分析，然后通过实时荧光定量PCR的方法对7个鱼类常用的内参基因:GAPDH、ACTB、β-MG、Rp18、EEF1α、g6bp、TUBA在多种试验因素处理下的稳定性进行了筛选。鲫鱼序列克隆所用的肝组织来自于健康的成年雌性鲫鱼，比较内参基因稳定性时，采用普通鲫鱼，一部分按年龄（一年龄和二年龄）、性别、水温（16℃和26℃）分为8组，饲养两周后取肝胰脏;另一部分选取健康成年雌鲫鱼，腹腔给予以下药物:乳糖酸阿奇霉素(25 mg/kg BW)、伊维菌素(0.05 mg/kg BW)、氟苯尼考(20 mg/kg BW)、烟酸诺氟沙星（50 mg/kg BW）、盐酸左旋咪唑(15 mg/kg BW)、头孢曲松钠(25 mg/kg BW)、阳性对照利福平(80 mg/kgBW)和阴性对照生理盐水(0.5 mL/kg BW)，连续给药7d后取肝胰脏。试验结果显示:本试验成功克隆了鲫鱼CYP3A、CYP4和PXR的部分序列，鲫鱼的CYP1A、CYP3A和CYP4T基因的保守性较高，但是与哺乳动物、禽类和非鲤科鱼类的亲缘关系较远;采用内参分析软件geNorm、NormFinder和BestKeeper分析表明，ACTB、TUBA和EEF1α是在试验因素处理下表达最稳定的基因，因此，本试验最终选择ACTB、TUBA和EEF1α三个基因作为该试验条件下的内参基因进行后续试验。
2.生理和环境因素对鲫鱼肝胰脏CYP450基因表达、蛋白表达和酶活性的影响。本试验系统性地评估了不同的生理因素（如年龄、性别）和环境因素（水温）对鲫鱼CYP450的基因表达、蛋白表达和酶活性的影响。试验采用普通鲫鱼80尾对不同处理因素进行交叉分组:按年龄分为一年龄和二年龄;按性别分为雌性和雄性;按水温分为16℃和26℃。饲养2周后取鲫鱼的肝胰脏分析CYP450的基因和蛋白表达以及酶活性。研究结果表明，水温、年龄、性别三种因素作用下鲫鱼肝胰脏CYP1A的mRNA表达水平、蛋白含量及酶活性呈现出不同的变化，这三项指标在年龄的变化上较一致，二龄鱼的mRNA、蛋白表达和酶活性均高于一龄鱼（雌鱼的mRNA表达水平除外）。CYP3A的mRNA相对表达量、蛋白含量及酶活性在三种因素作用下，呈现出明显的规律性:水温26℃时三项指标高于16℃时，在二龄鱼高于一龄鱼，雌性略高于雄性（除了一龄鱼的蛋白含量雌性略低于雄性）。年龄、性别、水温对其他指标的影响也有很大差别，CYP4T mRNA表达量的变化规律与CYP1A相似，而且存在显著差异，PXR mRNA表达量的变化与CYP3A接近;鲫鱼相对肝重和CYP450含量变化较小，微粒体蛋白含量一龄鱼在16℃时较高，二龄鱼则在26℃较高，年龄上一龄高于二龄，性别上雄性高于雌性;APND活性的变化与微粒体蛋白含量完全相反;AH的活性变化在温度和性别上与微粒体蛋白含量相同，在年龄上则相反。本试验建议，不同的生理和环境因素对鲫鱼CYP450的基因、蛋白表达和酶活性有一定的影响，在水产临床上，应该根据不同的生理状态和环境因素制定合理的给药方案，以免发生药物相互作用。
3.药物对鲫鱼肝胰脏CYP450基因表达、蛋白表达和酶活性的影响。为了研究药物对鲫鱼CYP450酶活性的影响，本试验从基因、蛋白和酶活性水平全面阐述了阿奇霉素、伊维菌素、氟苯尼考、诺氟沙星、左旋咪唑和头孢曲松钠对鲫鱼肝胰脏微粒体CYP450酶作用的影响。试验选取健康成年雌性普通鲫鱼，分别腹腔注射乳糖酸阿奇霉素(25 mg/kg BW)、伊维菌素(0.05 mg/kg BW)、氟苯尼考(20 mg/kg BW)、烟酸诺氟沙星(50 mg/kg BW)、盐酸左旋咪唑（15 mg/kg BW）、头孢曲松钠(25 mg/kg BW)、阳性对照利福平(80 mg/kg BW)和阴性对照生理盐水(0.5 mL/kg BW)，连续给药7d后取肝组织，采用荧光定量PCR、Western Blot和酶的生化反应方法测定药物对鲫鱼CYP酶系的影响。结果表明:阿奇霉素对基因和蛋白水平影响微弱，但是显著抑制了CYP3A和1A的标志性反应ERND和EROD的活性，伊维菌素和氟苯尼考主要通过转录后调节抑制鲫鱼CYP1A和3A的活性，诺氟沙星只对ERND的活性有显著抑制（P＜0.05），左旋咪唑在体内对CYP3A的蛋白含量、酶活性和PXR的mRNA表达有微弱的诱导作用，头孢曲松对APND活性具有显著的抑制作用(P＜0.05）。由此可见，阿奇霉素、伊维菌素、氟苯尼考、烟酸诺氟沙星、头孢曲松钠对鲫鱼CYP450酶系活性具有不同程度的抑制作用，因此，在水产临床上这些对CYP450酶活性有抑制作用的药物与其他药物联合用药时，可能会造成药物间相互作用。单独长期使用这些药物，CYP450酶活性的抑制作用则可能会造成药物的残留。
4.药物对鲫鱼CYP1A和CYP3A活性的抑制作用机制的体外研究。为了进一步了解药物对鲫鱼CYP450活性产生影响的作用机制，本试验采用体外肝微粒体温孵法评价了CYP1A和3A的经典抑制剂α-萘黄酮和酮康唑以及阿奇霉素、伊维菌素、氟苯尼考、诺氟沙星、左旋咪唑、头孢曲松对鲫鱼CYP1A的活性标志反应（非那西丁O-脱乙基化）与CYP3A的标志性反应（咪达唑仑1-羟基化）的抑制程度及抑制机制。在体外微粒体体系中，以对乙酰氨基酚和1-羟基咪达唑仑的生成速率反映CYP1A与CYP3A的活性。鲫鱼代谢非那西丁和咪达唑仑的过程符合米曼氏动力学特征，代谢非那西丁的Vmax为0.098 nmol/mg/min，Km为36.8μM，代谢咪达唑仑的Vmax为0.029nmol/mg/min，Km为12.16μM;α-萘黄酮对鲫鱼非那西丁的代谢呈非竞争-反竞争性混合型抑制作用，IC50=0.13μM，Ki=0.58μM，而伊维菌素、氟苯尼考、诺氟沙星、左旋咪唑均为竞争性抑制作用，IC50值分别为6.34μM、30.07μM、25.49μM、14.33μM，Ki值分别为4.37μM、33.24μM、28.06μM、54.17μM;酮康唑对咪达唑仑1-羟基化活性的可逆抑制机理与伊维菌素、诺氟沙星和左旋咪唑相同，均为竞争性抑制，IC50值分别为0.034μM、2.825μM、18.7μM和5.031μM，Ki值分别为0.44μM、12.83μM、48.24μM与61.82μM，氟苯尼考呈现出竞争-非竞争性混合型抑制作用，IC50=35.89μM，Ki=61.82μM;未检测到阿奇霉素与头孢曲松对非那西丁和咪达唑仑代谢的抑制作用;体外检测到除诺氟沙星外其余5种药物均对非那西丁和咪达唑仑代谢呈现不同程度的时间依赖性抑制作用，诺氟沙星只对咪达唑仑的代谢有不可逆抑制作用。结果表明，α-萘黄酮和酮康唑为鲫鱼CYP1A和3A的强抑制剂，伊维菌素对CYP1A和3A的抑制作用较强，而氟苯尼考、诺氟沙星、左旋咪唑对二者的抑制作用较弱，但是随着作用时间的延长，这种抑制作用可能增强，导致药物的相互作用。
综合本论文的研究结果可见，鲫鱼的CYP450活性会因年龄、性别和水温的差别而产生变化，试验涉及的几类抗菌、抗寄生虫药物对鲫鱼的CYP450酶系均有一定的抑制作用，其作用特征与调节机制与其他动物有很大区别，因此，对鱼类CYP450的调节机制进行系统研究是非常有意义的。了解鱼类与其他动物的用药区别，对提高药物疗效，避免药物间的相互作用，降低食品动物的药物残留都有非常重要的作用。