背景:胃癌在我国是一种常见多发的恶性肿瘤,其在国内的发病率及死亡率均居恶性肿瘤的前列。然而,目前有关胃癌发生发展的遗传学、以及表观遗传学机制远未完全揭示,仍然存在很多未知之处,从而造成诊断和治疗上的各种困难。迄今的研究初步明确胃癌的发生发展与多种抑癌基因失活或癌基因的活化密切相关,但目前关于胃癌抑癌基因的认识还存在很多不足之处。因此,进一步探索新的抑癌基因功能改变与胃癌发生发展及其恶性特征的关系、揭示其发生发展的具体分子机制,对胃癌早期诊断、设计合理治疗药物、判断愈后、进一步提高我国胃癌的诊治水平具有重要意义。泛素是一个高度保守的多肽,其由76个氨基酸残基组成,在蛋白质降解途径中,由泛素介导的是一个特异性蛋白质降解途径,其受到严苛的时间和空间的调控。由于ATP起催化作用,泛素连接酶（ubiquitin ligase,E3）将泛素转移至底物,底物蛋白在多泛素修饰后进入蛋白酶体（proteasome）最终进行完全的降解。E3的作用是招募E2和具有特异性的底物,并介导泛素从E2转移到靶蛋白,由此可见,整个蛋白质的降解过程中E3发挥了至关重要的作用,包括连接作用,并有着反应特异性的决定权。泛素蛋白酶途径是细胞生命过程中一个重要和关键的通路,负责降解有缺陷的蛋白,有缺陷的蛋白如果不去除就会对细胞造成各种应激性的损伤。泛素系统可标记这些缺陷蛋白质,并将其通过细胞内蛋白酶体途径降解。该系统还能消除不再需要的功能性和健康的蛋白,从而调节这些蛋白所控制的过程。现有的资料表明泛素蛋白酶途径的异常激活或者失活与多种肿瘤,包括胃癌的发生发展,具有直接的相关性。NF-κB信号通路与细胞增殖、炎症、生存、变化密切相关。在NF-κB蛋白家族中,NF-κB p65的作用最为人熟知。当p65进入核内后,可以促进多种基因的转录,最终导致细胞生长和肿瘤演化。近期研究发现,Kip1泛素-促进复合体1（Kip1 ubiquitination-promoting complex 1,KPC1）具有泛素连接酶的活性,可以通过泛素化调节NF-κB1 p65,使之经泛素蛋白酶体途径降解,经降解剪切后形成有活性的p50。p50可以促进肿瘤抑癌信号的表达,而且它的高表达可以下调p65,下调原癌基因的表达。此外,研究同时发现,与人正常组织相比,人肿瘤细胞中KPC1和p50表达下调,说明KPC1可能通过调控p50的表达而发挥抑制肿瘤发生的作用。但目前对KPC1的研究报道非常局限,KPC1在胃癌中的作用、作用机制及临床意义等也未见文献报道,如能明确其在胃癌中的抑癌作用及其临床意义,则有可能将其作为胃癌病人预后预测的生物标志物,并可能作为抗肿瘤药物设计新的靶点。本研究的重要意义在于不仅深入探索了KPC1的生物学功能和临床意义,以及将其作为胃癌病人预后预测的标志物的可能性,而且运用可靠的筛选技术探索KPC1抑制肿瘤发生的具体分子机制,为进一步研究适用于胃癌的生物药物和治疗方案提供了新的方法和思路。目的:1.检测KPC1及NF-κB p50在临床胃癌组织标本中的表达情况,分析两者与病人临床病理特征如病理分级、转移等的相关性,研究KPC1表达变化的临床意义2.通过探讨KPC1与NF-κB p50在胃癌组织中的表达关系,了解KPC1在NF-κB通路中的作用,并揭示与KPC1相互作用的靶蛋白。3.采用甲基化基因检测技术对胃癌细胞中KPC1启动子进行甲基化状态分析,探讨KPC1启动子甲基化对其在胃癌细胞中表达的影响。4.应用逆转录病毒体系体外过表达及沉默KPC1,检测其对胃癌细胞增殖的影响,为在后续实验中研究其对胃癌细胞周期、细胞凋亡和细胞迁移的影响奠定基础。方法:1.采用组织免疫化学染色的方法检测159例临床胃癌组织标本,分析KPC1及NF-κB p50的表达水平与临床胃癌发展、预后的关系,为后续实验奠定基础。2.采用RT-PCR、Western blot检测三株不同分化的胃癌细胞系中KPC1及NF-κB p50的m RNA和蛋白表达水平。3.通过生物信息学在线软件预测KPC1的启动子区域及其潜在的转录因子结合位点,采用甲基化特异性聚合酶链式反应（methylation-specific polymerase chain reaction,MSP）和亚硫酸盐测序PCR（bisulfate sequencing PCR,BSP）技术对KPC1启动子甲基化分析;4.观察甲基转移酶抑制剂5-Aza-Cd R对五种不同分化的胃癌细胞系的甲基化的影响,为后续研究KPC1甲基化和表达的关系奠定基础;5.基于基因克隆技术,运用逆转录病毒基因转染技术,在逆转录病毒表达质粒p Babe-puro载体中将KPC1片段克隆到其中,经酶切、测序进行鉴定,判断正确无误后,与KPC1片段共转染至Phi-NX细胞中,并进行病毒包装,定向亚克隆到载体p Super-retro-puro上。将包装的高表达逆转录病毒感染胃癌细胞,最后成功构建如下细胞系:建立KPC1基因高表达的细胞系—用含有p Babe-puro、p Babe-puro-KPC1的逆转录病毒感染SGC-7901和AGS;建立KPC1基因沉默细胞系—用含有p Super-retro-puro或p Super-retro-puro-sh.KPC1的逆转录病毒感染MGC-803,扩增感染成功胃癌细胞,而后经初步筛选形成稳定株,然后经RT-PCR鉴定后,培养扩增、冻存活性稳定的细胞株。6.采用MTT比色法检测稳定的高表达KPC1重组细胞的增殖生长情况,并采用平板克隆形成实验检测在体外重组细胞的克隆形成能力。结果:l.在159例临床标本中,通过免疫组化染色显示,KPC1在细胞质里存在表达,其表达深度与肿瘤分化程度呈现正相关,在对病理因素分析所得提示KPC1表达与胃癌TNM分期、转移、肿瘤分化程度等情况相关（P＜0.05）,但是与患者年龄、病灶大小等无明显相关性（P＞0.05）。2.NF-κB p50可散在分布在组织切片内中,定位胞质和（或）胞核内,高分化组织中内在胞质中表达较多,胞核中表达较少,而低分化组织中NF-κB p50于核内分布,胞质中表达弥散,散在分布,弱阳性表达;NF-κB p50表达与胃癌TNM分期、肿瘤分化程度等情况相关（P＜0.05）,而与患者年龄、病灶大小、转移情况等无明显相关性（P＞0.05）,这与KPC1的表达在病理因素分析上基本一致。Spearman相关性分析所得提示,KPC1与胞质NF-κB p50表达呈正相关（r=0.427,P＜0.05）。以上结果显示,KPC1与胞质中NF-κB p50呈现共表达,因此提示KPC1与NF-κB p50在胃癌发生机制中起到抑癌因子的作用,两者相互作用。3.根据检测结果我们发现KPC1启动子超甲基化与其低表达有关,对多种胃癌细胞系KPC1基因启动子的甲基化水平进行分析显示,多数胃癌细胞中KPC1基因启动子发生了超甲基化,包括MKN45、SGC-7901、AGS细胞系;且当在胃癌细胞中加入DNA甲基化转移酶抑制剂5-Aza-Cd R去除超甲基化后,可逆转胃癌细胞中KPC1启动子超甲基化导致的表达降低,我们通过RT-PCR检测5种不同胃癌细胞系在5-Aza-Cd R去除超甲基化后KPC1表达均增加,胃癌KPC1的低表达和其启动子的超甲基化的关系。4.逆转录病毒表达载体p Babe-puro经酶切和测序鉴定构建成功,并与KPC1在Phi-NX细胞中包装得到了高表达KPC1的逆转录病毒。该病毒感染的胃癌细胞SGC-7901和AGS,经筛选得到了稳定的重组细胞株。重组细胞株经RT-PCR实验证实构建成功。5.MTT实验中高表达KPC1的胃癌SGC-7901、AGS、MKN45重组细胞株,体外生长速度明显慢于对照细胞;平板克隆实验显示KPC1高表达后,SGC-7901、AGS、MKN45的胃癌细胞重组细胞株的体外克隆生长能力相比于对照细胞处于明显的弱势,克隆形成的大小也小于对照组细胞,差异具有统计意义。因此,以上结果表明,KPC1作为抑癌基因可能通过NF-κB p50控制NF-κB通路从而抑制胃癌细胞的侵袭力,并且通过KPC1启动子的甲基化可以调节其在胃癌细胞中的表达。结论:1.通过研究临床胃癌组织,KPC1和胞质NF-κB p50在胃癌中协同作用,促进抑癌基因的表达,提示KPC1可能是一个新的胃癌抑制因子,通过NF-κB p50控制NF-κB通路,从而限制肿瘤细胞的生长,起到抑制胃癌的恶性发展,为肿瘤治疗提供了新的研究方向和潜在治疗靶点。2.KPC1及NF-κB P50在高分化胃癌细胞系中蛋白及m RNA水平呈现高水平表达,在低分化胃癌细胞系中低表达;利用基因克隆技术、逆转录病毒包装技术和蛋白电泳验证我们已经成功构建p Babe-puro-KPC1重组质粒,通过MTT实验和平板克隆形成实验证实高表达KPC1可抑制胃癌SGC-7901、AGS、MKN45重组细胞株的体外增殖和生长,KPC1可以明显抑制胃癌细胞的增殖,3.KPC1基因启动子超甲基化可抑制其表达,表明其在胃癌的发生、发展中起重要作用,并能够作用NF-κB p50通路,KPC1对胃癌细胞的增殖具有重要的作用,在胃癌的发生发展中可能扮演重要角色