论文部分内容阅读
棉花是我国重要的经济作物,棉花枯萎病是严重影响棉花生产的主要病害,棉花抗病分子育种是防治枯萎病的有效途径。目前,挖掘棉花抗枯萎病相关功能基因并开展其分子机制研究,对于我国利用现代生物技术加快培育高产优质抗病棉花新品种具有重要的现实意义。WRKY转录因子是植物中特有的一类转录因子,在植物的生长发育、逆境胁迫（生物因素和非生物因素）等方面具有重要的调节功能。WRKY转录因子分为I、Ⅱ和ⅡI三个家族,其中Ⅱ家族又分为五个亚族（Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe）。由于在调控植物对逆境胁迫抗性方面的重要作用,近年来Ⅱc亚族WRKY转录因子已成为植物抗逆分子生物学领域的研究热点,但是关于其调控植物免疫反应的分子机制仍不清楚。本研究以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）为研究对象,对Ⅱc亚族WRKY转录因子调控棉花枯萎病抗性的生物学功能及分子机制进行了深入解析,丰富了植物WRKY和MAPK的理论体系,并为棉花抗病分子育种提供了新的思路。主要研究结果如下:（1）Ⅱc亚族WRKY转录因子正调控棉花对枯萎病菌的抗性。通过对接种及未接种枯萎病菌的野生型棉花进行转录组测序分析发现,接种枯萎病菌后棉花中7385个基因的表达水平上调,8480个基因的表达水平下调。进一步对差异表达的转录因子进行聚类分析,发现WRKY转录因子是表达变化最显著的转录因子家族;其中,表达上调的WRKY转录因子（52个）主要富集于Ⅱ类c亚族（23个）,表明Ⅱc亚族WRKY转录因子在棉花响应枯萎病菌侵染过程中发挥重要的作用。利用病毒介导的基因沉默技术分别获得了12个Ⅱc亚族WRKY转录因子沉默的棉花。生物学功能分析发现,沉默Ⅱc亚族WRKY转录因子后,棉花对枯萎病菌的抗性均显著下降。进一步的实验发现,分别超表达4个Ⅱc亚族WRKY转录因子的转基因烟草对枯萎病菌的抗性均显著增强。（2）Ⅱc亚族WRKY转录因子调控枯萎病菌诱导的Gh MKK2转录。利用染色质免疫共沉淀测序技术,筛选鉴定Ⅱc亚族WRKY转录因子共同调控的启动子,一共得到了516个含有W-box基序的启动子区段。将染色质免疫共沉淀测序数据与接种枯萎病菌的野生型棉花转录组测序数据进行联合分析,筛选得到52个表达受Ⅱc亚族WRKY转录因子调控的枯萎病菌响应基因。Gh MKK2（Cot AD23706）是筛选得到的靶基因之一,为棉花A组MKK基因。酵母单杂交实验、荧光素酶报告实验及电泳迁移率检测实验结果均表明,Ⅱc亚族WRKY转录因子均能特异性地与Gh MKK2启动子区的W-box基序结合。另外,表达模式分析表明,在超表达Ⅱc亚族WRKY转录因子的棉花原生质体中,Gh MKK2的表达水平显著上调。（3）Gh MKK2正调控棉花对枯萎病菌的抗性。利用病毒介导的基因沉默技术在棉花中沉默Gh MKK2后发现,棉花对枯萎病菌的抗性显著下降,病菌的生物量显著高于对照棉花。利用农杆菌介导的叶盘转化法,获得了Gh MKK2基因超表达的转基因烟草。抗病性分析发现,超表达Gh MKK2基因的转基因烟草对枯萎病菌的抗性显著提高。（4）Ⅱc亚族WRKY转录因子促进Gh MKK2介导的类黄酮生物合成,进而提高棉花的免疫反应。通过分析接种和未接种枯萎病菌的野生型、沉默Gh MKK2基因棉花的转录组测序结果,发现了3026个枯萎病菌诱导且表达受到Gh MKK2调控的基因。KEGG通路富集分析表明,这些基因显著富集在类黄酮生物合成途径（KEGG:ath00941）。进一步检测发现,接种枯萎病菌的Gh MKK2基因沉默棉花中类黄酮合成相关基因的表达水平显著下降,总类黄酮含量显著减少;而Gh MKK2基因超表达的棉花原生质体中类黄酮合成相关基因的表达水平显著上调;接种枯萎病菌的Gh MKK2超表达转基因烟草中,总类黄酮含量也显著增多。进一步研究表明,Ⅱc亚族WRKY转录因子超表达的棉花原生质体中类黄酮生物合成相关基因的表达水平显著提高;接种枯萎病菌后,超表达Ⅱc亚族WRKY转录因子的转基因烟草中总类黄酮的含量显著高于对照烟草。（5）Gh MKK2-Gh NTF6级联信号通路调控棉花中枯萎病菌诱导的类黄酮生物合成。利用酵母双杂交实验对Gh MKK2介导的MAPK级联信号通路下游MAPK组分进行鉴定,发现棉花中B组MAPK成员Gh NTF6（Cot AD09564）与Gh MKK2之间具有互作关系。荧光素酶互补成像实验及免疫共沉淀实验进一步证明,Gh NTF6与Gh MKK2互作。枯萎病菌抗性分析结果表明,Gh NTF6沉默显著降低了棉花的枯萎病菌抗性,而Gh NTF6超表达则显著增强了转基因烟草对枯萎病菌的抗性。进一步研究发现,接种枯萎病菌的Gh NTF6沉默棉花中类黄酮生物合成相关基因的表达水平显著下降,总类黄酮含量减少;而Gh NTF6超表达的棉花原生质体中,类黄酮生物合成相关基因的表达量显著提高;另外,Gh NTF6超表达的转基因烟草叶片接种枯萎病菌后,总类黄酮的累积显著高于对照烟草。（6）Gh MYC2作为Gh MKK2-Gh NTF6级联信号通路的底物,调控棉花的抗病性。通过酵母双杂交筛库实验,以Gh NTF6-BD为诱饵载体,筛选得到棉花中Gh MKK2-Gh NTF6级联信号通路下游互作蛋白,Gh MYC2（Cot AD32778）。通过酵母双杂交实验、荧光素酶互补成像实验及GST pull-down实验,验证了Gh MYC2与Gh NTF6的互作关系。枯萎病菌抗性分析表明,Gh MYC2沉默后,棉花对枯萎病菌的抗性显著下降。进一步分析发现,Gh MYC2沉默棉花接种枯萎病菌后,类黄酮生物合成相关基因的表达水平显著下降,总类黄酮含量显著减少;而Gh MYC2超表达棉花原生质体中类黄酮合成相关基因的表达水平显著升高。综上所述,本研究明确了Ⅱc亚族WRKY转录因子提高棉花抗病性的生物学功能,解析了Ⅱc亚族WRKY转录因子通过调控Gh MKK2-Gh NTF6-Gh MYC2级联信号通路促进类黄酮生物合成,进而提高棉花免疫反应的分子机制,为棉花抗病遗传育种与栽培提供了新的思路和实践方向。