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肝脏是氨氮代谢的主要器官,来自肠道的血氨经门静脉进入肝脏主要通过尿素循环代谢。猪门静脉血氨浓度是循环系统其他部位的10倍,课题组前期研究发现随着日粮蛋白水平的升高,猪门静脉血氨浓度达到250μmol/L-350μmol/L。本课题旨在研究门静脉血氨对仔猪肝脏氨基酸代谢的影响。首先通过安装门静脉-肝静脉插管建立仔猪门静脉灌注技术;通过门静脉灌注高浓度（75mmol/L）和低浓度（25mmol/L）的氯化铵（Ammonium chloride,NH4Cl）溶液,采集肝静脉血液以及肝脏组织样品,基于气相色谱-质谱联用（Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）的代谢组学分析了血液中的代谢产物变化;数字基因表达谱分析了肝脏组织基因表达,并检测了相关代谢酶活性;最后利用15N同位素研究NH4Cl对肝细胞氨基酸代谢影响的机制。主要的研究结果如下:（1）仔猪肝脏门静脉灌注技术的建立:通过门静脉血流速率以及摄食前后门静脉血氨的浓度,计算出门静脉血氨流量（μmol/min）;设定体外灌注泵的速率（mL/min）,计算出体外灌注氨的浓度;仔猪安装门静脉-肝静脉插管,待恢复健康后利用灌注泵通过门静脉插管进行体外灌注NH4Cl溶液。通过检测肝静脉血液尿素含量发现,随着门静脉灌注NH4Cl的浓度增加,血液中尿素浓度也增加。这些结果证实了仔猪肝脏门静脉灌注技术的可靠性。（2）GC-MS分析结果显示:灌注不同浓度的NH4Cl引起12种血清差异代谢产物（P<0.05）;与低浓度NH4Cl相比,门静脉灌注高浓度NH4Cl导致尿素和谷氨酰胺合成明显增加（P<0.05）,同时葡萄糖和葡萄糖-6磷酸也显著增加（P<0.05）;相反地,在高浓度组中丙氨酸（Alanine,Ala）、天冬氨酸（Aspartate,Asp）、谷氨酸、鸟氨酸、精氨酸等氨基酸含量大量降低（P<0.05）,其中Ala差异变化最大。（3）数字基因表达谱分析结果显示:与低浓度组相比,高浓度组中共有1164个差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）,其中有901个DEGs上调,263个DEGs下调。在这些DEGs中,尿素循环相关基因如N-乙酰谷氨酸合成酶、氨甲酰磷酸合成酶1、鸟氨酸氨甲酰转移酶、及精氨酸酶1基因表达大量上调;氨华中农业大学2016届硕士研究生学位（毕业）论文基酸相关代谢酶基因也发生明显的变化,如谷氨酰胺合成酶、鸟氨酸氨基转移酶等;通过定量PCR验证测序结果发现一致性较高,说明测序结果准确可靠。（4）肝脏代谢酶活性分析结果显示:高浓度组中氨甲酰磷酸合成酶1、精氨酸1、谷氨酰胺合成酶活性显著（P<0.05）高于低浓度组;而高浓度组中鸟氨酸氨甲酰转移酶（P=0.054）和谷氨酰胺酶（P=0.065）活性较低浓度组有增加的趋势;并且随着NH4Cl灌注浓度的增加,肝脏中丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase,ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotrasferase,AST）活性分别提高了45.89%（P=0.039）和41.08%（P=0.045）。这些结果说明门静脉灌注氨导致ALT和AST酶活性增加。（5）通过GC-MS分析不同15N底物条件下尿素和Asp中15N丰度,结果显示:当肝细胞培养在15NH4Cl中,尿素中两个氮原子只有一个氮被大量标记（Urea（m+1））,Asp中15N标记量很少;当在肝细胞中添加NH4Cl和15N-Ala时,尿素只有一个氮原子被大量标记,且Asp也被大量标记,其15N丰度是15NH4Cl组的4倍（P<0.05）;当同时添加15NH4Cl和15N-Ala时,尿素中两个氮原子均被大量标记,Asp中15N丰度与15N-Ala+NH4Cl组没有明显差异（P>0.05）,然而Urea（m+1）中15N丰度明显减少（P<0.05）。这些结果表明氨不能为尿素循环提供两个氮原子,Ala通过转化成Asp为尿素合成提供前体物质。综上所述:门静脉血氨进入肝脏尿素循环后,氨只能为尿素提供一个氮源,另外一个氮源主要是通过氨基酸代谢供给;因此,氨进入肝脏尿素循环后会诱导Ala代谢,在ALT和AST的作用下合成Asp,为尿素合成提供额外的氮源。