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Myostatin(MSTN)又称为GDF-8，属TGF-β超家族，是一种主要在动物骨骼肌中特异性表达的肌肉生长负调控因子。Myostatin基因超量表达可以导致动物肌肉萎缩，而其突变则使动物产生双肌现象。Myostatin基因敲除小鼠的体重比对照组提高30％，肌肉量增加一倍，但对生存和繁育并未产生负面影响。已经发现Myostatin基因自发突变双肌牛的存在，但人为敲除Myostatin基因的畜禽尚未成功建立。本试验选用产仔率较高的中国小尾寒羊为研究对象，从小尾寒羊基因组中扩增出4.6kb和0.8kbMyostatin基因片段，分别作为打靶载体的5’同源长臂和3’同源短臂，以载体pGEM-3Zf(-)为骨架，以Neo和EGFP为标记基因和报告基因，构建了带有双筛选标记的无启动子且无PolyA信号的绵羊Myostaitn基因打靶载体p3Zf-MSTN，并以小尾寒羊胎羊为材料分离并纯化了小尾寒羊原代骨骼肌成肌细胞，为通过基因打靶获得Myostatin基因第三外显子部分序列缺失的绵羊体细胞和利用体细胞克隆建立Myostatin敲除的绵羊模型提供了条件，为进一步在细胞和动物水平验证Myostatin缺失与畜禽肌肉超常发育的关系和探索利用Myostatin基因敲除改良畜禽生长性能的可能性奠定了基础。本试验在打靶载体标记基因和报告基因的两端引入了loxP序列，以期利用Cre/loxP系统去除筛选基因和报告基因，以排除筛选基因和报告基因对Myostatin功能研究的影响，也为生产能够安全食用的绵羊新品种奠定基础。
相比于Myostatin的基因与蛋白结构及其生物学功能而言，对Myostatin基因的转录和表达调控机制了解甚少。尽管绵羊Myostatin的cDNA序列已经克隆，但其5’调控区序列仍然未知。为了更好地了解绵羊Myostatin基因5’调控区的结构和功能，深入研究绵羊Myostatin基因的转录调控机制，本试验选用中国小尾寒羊为材料，克隆了包括1.211kbMyostatin启动子(Pro)的1.517kb基因片段(GenBank登录号为AY918121)，并对一些重要的调控元件进行了鉴定。序列比较分析表明，绵羊1.211kb(注：以下简称1.2kb)Myostatin启动子(AY918121)与山羊(AY827576)、牛(AJ438578)、猪(AY527153)、人(AX058992)和鼠(AY204900)启动子的同源性分别为98.1％、95.8％、86.9％、80.2％和67.7％。MatInspecter分析表明1.2kb的绵羊Myostatin启动子区存在3个TATAbox、1个CAATbox和8个E-box。另外，也发现存在Octamer、API、Gri-1B、MEF2、MTBF、GRE和PRE等重要调控元件。对猪、牛、山羊和绵羊Myostatin基因5’启动子区一些重要调控基元的比较表明，各种调控元件在数量和位置上既存在保守性，也存在变异性。
为了进一步鉴定以上调控元件，以EGFP为报告基因，构建了各种长度的野生型MSTNProW-EGFP载体和一些调控元件突变后的突变型MSTNProM-EGFP载体，通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系，对各种情况下EGFP的瞬时或稳定表达进行了荧光强度定量分析。结果表明不含任何启动子的pEGFP-N1(4.1kb)阴性对照质粒载体几乎没有EGFP表达，而0.3～1.2kb的绵羊Myostatin启动子都能不同程度地驱动EGFP在C2C12细胞中的转录和表达，其中1.2kb片段的转录调控活性最高。然而将绵羊1.2kbMSTNProW-EGFP载体转染绵羊成纤维细胞后并未观察到EGFP的表达，这一结果再次验证了Myostatin转录和表达的肌肉特异性。绵羊1.2kb的Myostatin启动子区多个E-box(E)元件的存在暗示了肌肉特异性调控元件E-box的重要性以及MRFs转录因子家族(如MyoD等)对绵羊Myostatin转录调控的可能性。突变分析表明E3、E4、E5和E7，尤其是E3、E5和E7，对绵羊1.2kbMyostatin启动子的转录调控活性具有重要影响。E3、E4和E5非常邻近的序列位置暗示了它们可能是共同作用于相应的转录因子，以族的形式维持DNA-蛋白结合的稳定性。E3和E5同时突变或E3、E5和E7同时突变并未比单独突变其中一个元件表现出显著差异。对稳定转染绵羊1.2kbMSTNProW-EGFP载体的C2C12细胞中EGFP表达的研究表明，细胞生长密度的增加可以反馈性抑制Myostatin的转录和表达，而且Myostatin在C2C12分化状态下的转录和表达量比成肌状态时显著升高。然而，对于稳定转染1.2kbMSTNProE357M-EGFP(E3、E5和E7同时突变)载体的C2C12细胞，EGFP的转录和表达量并未表现出分化和生长状态时的差别。这一结果暗示了MyoD可能是通过E-box引起Myostatin在C2C12分化和生长状态时转录和表达差异的原因，因为MyoD是参与成肌分化的一个主要因素。突变分析表明靠近绵羊Myostatin启动子序列第三个TATA-box上游的MEF2元件(MEF2-1)对绵羊1.2kbMyostatin启动子的转录调控活性具有显著的增强效应，而利用MatInspecter分析的另外一个MEF2元件(MEF2-2)没有产生预期的效应。另外，在我们的试验中还鉴定了对绵羊Myostatin启动子转录调控活性具有显著影响的另外一个肌肉特异性调控元件MTBF。GRE调控元件的突变使绵羊1.2kbMyostatin启动子的转录调控活性显著降低，一定剂量的糖皮质激素(地塞米松)可以显著增加绵羊1.2kb野生型Myostatin启动子的转录调控活性，而对GRE元件突变后的Myostatin启动子影响不显著，暗示了糖皮质激素可能通过作用于GRE元件促进绵羊Myostatin的转录和表达，进而抑制肌肉的发育。糖皮质激素受体抑制剂RU-486能够显著抑制糖皮质激素对绵羊1.2kb野生型Myostatin启动子转录调控活性的促进效应，意味着糖皮质激素和GRE调控元件的作用是通过糖皮质激素受体介导的。PRE元件的突变或孕激素的添加均使绵羊1.2kbMyostatin启动子的转录调控活性明显降低，这两种相互矛盾的结果说明利用MatInspecter分析的PRE元件可能是非孕激素作用的另一元件，而孕激素对绵羊1.2kbMyostatin启动子转录调控活性的明显降低可能是由于孕激素的间接作用。