嗜水气单胞菌分离鉴定、分型及环境因子影响的研究

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嗜水气单胞菌可引起鲫、团头鲂、鲢和鲤等多种鱼类感染细菌性败血症,给鱼类养殖业带来了巨大的经济损失。对细菌进行准确的鉴定,才能方便进行后续的研究以及疾病的防控。在细菌常规鉴定中,一般的方法是细菌的形态学鉴定并辅以生化试验。由于细菌作为单细胞生物,具有多态性、易变异,某些生化反应不稳定等原因,仅依靠形态和生化反应难以准确鉴定。因此寻求其他准确、快捷的细菌鉴定方法具有重要意义。目前原核生物的16S rDNA序列分析已成为细菌种属鉴定和分类的标准方法。本实验从不同地域发病池塘的不同生态位分离细菌,综合细菌形态学观察、分子鉴定、生理生化测定,以及构建的系统发育树和同源性的分析对分离到的细菌进行鉴定。生理生化特征显示为能分解利用甘露糖、蔗糖、枸橼酸盐、丙二酸盐、尿素、胆汁七叶苷等,不发酵松三糖、蜜二糖、肌醇等,发酵型,葡萄糖产酸产气。对菌株WJ11-5基因序列测序结果显示16S rRNA基因长度为1450bp,在GenBank的登录号为:JN836334,将菌株所扩增的基因序列在NCBI通过Blast进行同源性检索,并采用邻接法构建菌株分子发育树,分离菌株16S rRNA基因在系统发育树上与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)(登录号:JF826531)聚为一支,同源性达99%以上。最终确定本实验中分离到的细菌为嗜水气单胞菌(A. hydrophila)。对采集自江苏、河南、福建等地淡水养殖区域的105株嗜水气单胞菌(A. hydrophila)进行了基因分型,探讨嗜水气单胞菌的基因型与区域分布及生态位的关联性。本实验以肠道细菌基因间重复共有序列PCR(ERIC-PCR)技术进行分型,应用Quantity one4.6对电泳图谱进行分析,采用非加权配对法(UPGMA法)做遗传分析的树状图。结果表明,105株嗜水气单胞菌可分为28个基因型。其中,XV基因型的菌株相对最多,IV, XI, XXII, XXV, XXVIII, XXVII, XXVI基因型的菌株相对最少。生态位背景来源相似的菌株有聚类趋势。此外,不同地域、不同生态位的嗜水气单胞菌也可能聚为同一种基因型。由此推断嗜水气单胞菌的基因型可能与生态位及地理位置有一定的关联性。选择团头鲂为试验鱼体,将分离出的105株嗜水气单胞菌进行人工回感实验,验证它们致病力的强弱。选出毒性最强的菌株做环境胁迫实验,研究环境胁迫因子和嗜水气单胞菌菌株致病力之间的关系。采用正交设计方法设计一个4水平因素(温度)和三个2水平因素(pH、亚硝酸盐、氨氮)的实验。模拟池塘养殖环境,分析显著影响菌体致病力的因素,并建立了鱼体存活时间与环境因子的回归方程y=164.713-6.399A+14.367B-11.914B×C;式中,y为鱼体存活时间以小时为单位。A(温度)的取值范围是20-32℃,B(pH)的取值范围是6.5-8,C(分子氨)的取值范围是0.02-0.04mg/L。结果显示温度、氨氮与pH的交互作用对鱼体存活长短的影响极其显著;pH单独的胁迫作用显著;亚硝酸盐的胁迫作用不显著。当温度为20℃,pH=8,分子氨浓度为0.02mg/L时,理论上7天内鱼体的存活时间最长为149.76小时。本文探讨了不同地区不同生态位嗜水气单胞菌之间的亲缘关系,模拟养殖水体环境,用回感实验选出的强毒株做环境胁迫实验,分析影响菌株致病力强弱的环境因素。建立回归方程以便于预测养殖鱼塘的发病情况。为嗜水气单胞菌流行病学的研究提供理论依据,并对该菌引起的细菌性败血症的预防具有一定指导意义。
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