研究背景：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球性的公共卫生问题。流行病学资料表明全世界约20亿人感染过HBV,其中约3.5-4亿感染者为慢性感染。人体感染HBV后,病毒和人体之间的相互作用影响着疾病的转归。目前文献报道HBV感染并不直接导致肝细胞损害,但病毒抗原成分介导的细胞免疫应答是导致肝脏炎症发生的主要机制,而T淋巴细胞免疫功能低下是病毒持续存在及炎症反复活动的主要原因。慢性HBV感染者在不同时期对病毒的免疫应答存在差异,据此在临床上可表现为免疫耐受期、免疫活跃期、非活动期和再活动期,并且不同时期机体内的病毒水平和肝脏损伤程度不尽相同。目前,国际公认的抗HBV药物包括干扰素a (interferon-a, IFN-a)和核苷(酸)类药(nucleos[t]ide analogue, NA)都不能直接清除肝细胞核内病毒共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA),停用抗病毒药后只有部分患者表现出持续的抑制病毒,更多患者会出现停药后复发。研究表明,抗病毒治疗后是否能够持续病毒学应答以及HBeAg血清学转换与人体的特异性细胞免疫应答的功能重建有关。因此,机体的免疫状态不仅影响慢性HBV感染的自然病程进展,而且影响抗病毒治疗的疗效。HBV感染建立后人体的免疫应答主要是细胞免疫,而T细胞是最主要的效应细胞。T细胞免疫应答包括T细胞受体(T cells receptor, TCR)的特异性识别、T细胞的增殖与分化、以及介导杀伤效应等一系列过程,其中各个环节均影响着机体的免疫应答效果。监测机体特异性细胞免疫应答的方法有很多,包括检测细胞因子分泌以及细胞频数、细胞毒试验、增殖试验等。近年来通过TCR指纹分析技术,对外周血和组织中T淋巴细胞的TCRβ链可变区(variableregion, BV)中互补决定区3(complementarity determining region 3, CDR3)谱系分析,能够了解机体的生理和病理状态下免疫功能的动态变化。研究还表明通过增强CD8+T淋巴细胞受体功能,可以有效控制HIV病毒的免疫逃逸；而将核心抗原特异性TCR基因转入慢性HBV感染者的T细胞,有利于HBV特异性细胞免疫功能重建。因此,研究HBV感染者TCR谱型及变化特点,对于进一步寻找新的抗病毒治疗方法、提升患者特异性细胞免疫状态有重要的意义。目的：1、研究慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者外周血T细胞亚群TCR BV CDR3谱型特点,以及验证TCR免疫指纹分析技术分析T淋巴细胞亚群TCR谱型的稳定性和重复性。2、研究不同临床期的慢性HBV感染者外周血T淋巴细胞亚群TCR BVCDR3谱型特点差异,为研究其自然病程进展的细胞免疫发生机制提供重要的线索。3、研究CHB患者在抗病毒治疗过程中CD8+T淋巴细胞亚群TCR BV CDR3谱型变化模式,试图寻找出与CHB患者抗病毒治疗后免疫功能重建有关的免疫学指标,用于早期预测抗病毒治疗的疗效。方法：1、选择5例慢性无症状HBV携带者(immuno-tolerant AsC, IT)、8例慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者、5例非活动性HBsAg携带者(inactive HBsAg carrier, IC),以及20例接受抗病毒治疗的CHB患者作为研究对象,并以正常人作对照。2、采集入选患者肝素抗凝外周静脉血10-30ml,应用密度梯度离心法常规分离外周血单个核细胞(PBMCs),取5×106 PBMCs,用磁珠分选方法阳选CD8+T细胞亚群,用流式细胞术鉴定分选细胞群中CD8+和CD4+T细胞的纯度。3、应用RNA提取试剂盒分别提取CD8+T淋巴细胞亚群和CD8-T淋巴细胞亚群的总RNA,应用逆转录试剂盒逆转录成cDNA。根据人TCR BV 24个基因家族的cDNA序列设计24个BV家族特异性的上游引物,从BC1和BC2的共同区设计一个BC下游引物(带FAM),每个标本分别进行BV1/BC-BV24/BC共24管PCR扩增,荧光标记的PCR产物初步在琼脂糖凝胶电泳分析其各家族转录体的表达情况。4、PCR产物送测序公司,应用ABI3730型DNA全自动序列分析仪进行扫描,测序结果通过GeneMarker分析软件对扫描结果进行分析。结果以峰型图的形式记录,每个峰与TCR BV家族CDR3片段大小碱基数(bp)相对应,对形态峰谱型偏移量化的具体判断参考以下标准：相对荧光密度(relative fluorescence intensity, RI) (%)=100%x每个峰曲线下面积/该家族曲线下总面积；(1)如果一个家族中出现1个优势峰,该峰的RI大于35%,考虑存在单克隆性增生；(2)如果一个家族中出现2个优势峰,两个峰的RI均需大于25%,考虑存在寡克隆性增生；(3)如果一个家族在多峰背景的基础上出现优势峰,且不同于正态分布,则这优势峰的RI需大于25%,考虑存在偏峰型克隆性增生。本研究采用24个TCR家族中发生谱型偏移的个数来衡量偏移程度的高低。5、统计学分析数据计量资料以均数±标准差表示,计量资料符合正态分布及方差齐性者采用参数检验,否则采用非参数检验。两样本比较采用独立样本t检验(Independent t test)或配对样本t检验(Paired t test);多个样本比较采用LSD-t检验或重复测量的方差分析；双变量相关分析采用等级相关(Spearman correlation);阳性计数资料采用确切概率法(Fisher’s exact test)。双侧检验P<0.05为差异有统计学意义。以上操作均采用SPSS13.0统计软件所提供的相关应用模块进行。结果：1.为了平衡细胞频数影响,选择细胞个数为1×105、1×106、3×106三个组别检测,从形态上看三个组别得出的TCR谱型总体形态十分相近,各家族主峰的相对荧光密度值分别为36.23±0.55%、25.70±4.36%、38.20±2.19%和30.83±1.53%,变异系数分别为0.015、0.170、0.057和0.050,展示了较小的变异程度。另外,对同一样本的两次检测结果表明具有良好的重复性。2.8例CHB患者外周血CD8+和CD8-T淋巴细胞亚群TCRBV家族CDR3谱型发生不同程度的偏移,表现为单克隆性、寡克隆性及偏峰型克隆性增生。而3例正常人外周血上述两个淋巴细胞亚群TCRBV家族CDR3谱型大致呈正态分布。3.总PBMCs的得出的TCR谱型掩盖了CD8+和CD8-T淋巴细胞亚群得出的谱型。4.8例CHB患者CD8+T淋巴细胞亚群发生TCRBV家族CDR3谱型偏移家族个数高于代表CD4+T淋巴细胞的CD8-T淋巴细胞群(Paired t test: 10.63±4.75 vs.4.13±3.09, t=6.62, P<0.001)。5.IT组、CHB组以及IC组其CD8+T淋巴细胞亚群均比代表CD4+T淋巴细胞的CD8-T淋巴细胞亚群表现更多的TCR BV家族CDR3谱型偏移,结果均有统计学意义(Paired t test:t=3.69, P=0.034; t=6.62, P<0.001; t=7.51, P=0.005)。6.IT组CD8+T淋巴细胞亚群TCR BV家族CDR3谱型偏移个数显著性少于CHB组和IC组(LSD-t test:P=0.033, P=0.038);而IC组TCR BV CDR3谱型偏移家族平均个数较CHB组高,但两者之间无统计学意义(P=0.863)。7.代表CD4+T淋巴细胞的CD8-T淋巴细胞亚群TCR BV家族CDR3谱型谱型偏移个数在慢性HBV感染者的免疫耐受期、免疫活跃期、非活动期3个不同临床期均较少,分别为1.50±1.30,4.13±3.09,4.75±3.60,且3组之间无统计学差异。8.抗病毒治疗48w后,根据病毒学应答情况分为2组：HBV DNA< 2.48 lg copies/mL属于病毒学应答组(virological response, VR),剩下的属于非病毒学应答组(non-virological response, NVR)。抗病毒治疗前TCR BV家族CDR3谱型偏移个数在VR组与NVR组中无统计学差异(Independent t test,5.77±2.62vs.7.71±4.19,t=-1.285,P=0.215)。另外,ALT和HBV DNA的水平与CD8+T淋巴细胞TCR BV谱型偏移家族个数没有相关性(Spearman correlation: RR=0.138, P=0.561; RR=0.017, P=0.944)。9.在VR组和NVR组在抗病毒治疗第12w TCR谱型偏移家族个数均比基线水平增多(5.77±2.60 Vs 8.77±3.39；7.71±4.19 Vs 8.57±4.43)；随着抗病毒治疗时间延长,VR组第24w TCR谱型偏移家族显著性高于第12w(P=0.028),而NVR组却显著性降低(P=0.012)；于是,根据12w和24w TCR谱型偏移个数变化趋势,可分为3种模式组别,分别为下降组、上升组、水平组。在抗病毒治疗第48w,下降组的6个患者HBV DNA仍阳性,上升组9个患者48w时HBV DNA水平均低于检测下限；且NVR组7个患者中属于下降模式的比率显著性高于VR组(Fisher’s exact test:P< 0.001);相反, VR组13个患者中属于上升模式的比率显著性高于NVR组(Fisher’s exact test:P=0.004)。10.20例CHB患者基线水平有14例(70%)患者的BV15家族扩增3次以上检测均为阴性,有13例(65%)患者的BV24家族均出现克隆性增生。抗病毒治疗过程中,VR组中46%患者在TCR BV2、BV4、BV5或BV9家族第24w时新出现克隆性增生,而在NVR组中有43%的患者在BV21家族在24w时新出现克隆性增生。结论：1.通过T淋巴细胞亚群磁珠分选后再分析其TCR BV家族CDR3谱型变化可以减少不同淋巴细胞亚群之间的谱型重叠干扰,该方法具有良好的稳定性和重复性,不受细胞数影响。相对于CD4+T淋巴细胞亚群,分析CHB患者外周血CD8+T淋巴细胞亚群TCR克隆性增生程度更有助于了解免疫清除期CHB患者炎症的发生机制。2.处于免疫耐受期的AsC其CD8+T淋巴细胞亚群TCR BV家族CDR3谱型偏移的程度不如处于免疫清除期的CHB患者和处于非活动期的Inactive carrier明显。3.抗病毒治疗第12w和24w之间CD8+T淋巴细胞亚群TCR BV家族CDR3谱型偏移家族个数变化模式可能反映着机体T淋巴细胞免疫状态,可作为抗病毒治疗后宿主免疫功能重建的参数,用于早期预示CHB患者抗病毒治疗的疗效。