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第一部分:IL-37对肝细胞肝癌细胞系的作用研究目的:探究IL-37的过表达对肝癌细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响,同时利用免疫缺陷小鼠肿瘤模型探究其对体内肝细胞肝癌发生发展的作用。方法:利用慢病毒表达系统构建表达IL-37的Hepa1-6稳转细胞系(Hepa1-6-IL-37)以及空载体对照(Hepa1-6-Venus),体外通过MTT,Ki67染色,细胞凋亡和周期实验检测IL-37对Hepa1-6生物学功能的影响。利用免疫缺陷NODSCID小鼠建立小鼠原位肝癌模型,取对数生长期的Hepa1-6-IL-37以及Hepa1-6-Venus细胞,通过手术原位种植的方法,将肿瘤细胞接种于小鼠肝脏中。2周后处死小鼠,测量小鼠肝脏肿瘤体积。结果:成功构建了表达IL-37的Hepa1-6稳转细胞系(Hepa1-6-IL-37)以及空载体对照(Hepa1-6-Venus)。体外实验结果表明,IL-37的过表达会抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞的凋亡,并将细胞周期阻滞在G2/M期。体内实验结果表明,IL-37对肿瘤生长的直接抑制作用在体内并不足以引起肿瘤生长的明显减缓,和对照组相比,肿瘤大小没有显著差异。结论:IL-37在体外可以直接抑制肝癌细胞系的增殖,促进其凋亡。但是对免疫缺陷小鼠肿瘤模型中肿瘤的生长没有影响。第二部分:IL-37在肝细胞肝癌中的作用及其免疫调节机制的研究目的:IL-37作为抑炎因子,其在肝细胞肝癌病人肿瘤中的表达水平和肝癌病人的预后呈正相关性,但是IL-37在肝细胞肝癌中的作用机制仍不清楚,因此我们将对这一问题进行研究。方法:通过构建三种不同的肿瘤模型,(a)取对数生长的Hepa1-6稳转细胞用PBS制备成单细胞悬液,使用高压水流动力学方法(HGT)通过尾静脉注射进入小鼠体内。3周后处死小鼠,分离小鼠肝脏,计算小鼠肝脏肿瘤结节数;(b)取对数生长的Hepa1-6稳转细胞系,通过手术原位种植的方法,将肿瘤细胞直接接种于小鼠肝脏中。2周后处死小鼠,分离小鼠肝脏,测量小鼠肝脏肿瘤体积;(c)取14-16d大小的C57BL/6雄性小鼠,腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN)诱导小鼠肝癌发生,之后每两个月通过HGT法注射IL-37体内表达微环质粒,在小鼠肝脏中过表达IL-37,8个月后处死小鼠,分离小鼠肝脏,计算小鼠肝脏肿瘤结节数以及测量肿瘤体积。此外,通过流式细胞术检测荷瘤鼠体内各免疫细胞亚群的分布情况,并通过胞内染色检测T细胞分泌表达IFN-γ和TNF-α的水平,同时检测小鼠CTL的细胞杀伤能力。通过DC与T细胞的共培养实验,探究IL-37促进T细胞杀伤能力的机制。结果:在三种不同的肿瘤模型中,IL-37的过表达均可以抑制肿瘤的发生发展。进一步的研究表明,IL-37可以促进T细胞的激活,并且可以显著提高脾细胞和肿瘤浸润淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤。IL-37对T细胞的激活功能是通过DC所介导的。结论:我们的结果证明,IL-37可以通过促进T细胞的激活抑制肝细胞肝癌的发生发展。这一作用可能是由于IL-37促进了DC对T细胞的激活功能。第三部分:IL-37在肝细胞肝癌发生发展过程中对肿瘤血管新生的作用目的:研究IL-37在肝细胞肝癌发生发展过程中对肿瘤血管新生的作用。方法:在小鼠原位肝癌模型中,分离小鼠肿瘤组织,使用CD31免疫荧光染色确定IL-37过表达对肿瘤组织以及癌周部位肿瘤血管新生的作用。通过Evans blue染色实验研究IL-37对小鼠肿瘤血管浸润的影响。在体外,使用重组IL-37蛋白以及Hepa1-6-IL-37肿瘤细胞培养上清探究IL-37对HUVEC细胞的增殖以及凋亡的作用。通过划痕实验以及基质胶血管生成实验探究IL-37对HUVEC成管能力的作用。并且通过real-time PCR检测IL-37对HUVEC分泌VEGF,MMP2,MMP9等促血管新生因子表达水平的影响。结果:IL-37过表达显著抑制肿瘤血管新生,尤其是癌周部位的血管新生。IL-37同时可以抑制肿瘤组织中的血管浸润。体外研究表明IL-37重组蛋白对HUVEC细胞的增殖和凋亡没有影响。然而,IL-37重组蛋白却可以提高HUVEC细胞的迁移以及体外血管生成能力。而使用Hepa1-6-IL-37肿瘤细胞培养上清刺激HUVEC,则发现该上清促进了HUVEC的凋亡,并且对HUVEC的迁移与血管生成能力有着明显的抑制作用。结论:IL-37的直接作用可以促进血管新生,但是在肿瘤微环境中,IL-37可能通过作用于肿瘤细胞而对肿瘤血管新生发挥抑制作用。