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目的:从“脾虚致消”的理论入手,通过饮片、组分、单体多个层次研究黄芪、葛根及其配伍对糖尿病脂肪组织脂肪因子与AMPK通路转导的调控作用,明确黄芪、葛根及其配伍调节糖尿病糖脂代谢的作用机制与有效物质。材料与方法:第一部分:文献研究通过整理古籍与现代文献,从消渴病因、病机、治疗方面论述脾与消渴的关系;通过膏脂的病因、病机与治疗论述脾与膏脂的关系。第二部分:实验研究实验一:86只SPF级雄性SD大鼠随机分为6组,分别为正常组、模型组、金芪降糖片组、黄芪组、葛根组、饮片配伍组,正常组11只,其余各组15只。除正常组外,一次性腹腔注射2%STZ(46 mg/kg)造模,造模同日给药,正常组、模型组分别予蒸馏水10 m L/kg,其他给药组分别予金芪降糖片混悬液1.47 g/kg、黄芪2.7 g/kg、葛根1.35 g/kg、黄芪葛根汤4.05g/kg,连续灌胃30d。生化法检测血糖、TG、CHO含量,ELISA法检测APN、LEP、TNF-α、GLUT-4含量,Real-time PCR法检测Chemerin、Chem R23、AMPK、GLUT-4、β-actin m RNA相对表达量。实验二:146只SPF级雄性SD大鼠随机分为10组,分别为正常组、模型组、金芪降糖片组、黄芪黄酮组、黄芪皂苷组、葛根黄酮组、黄芪黄酮+黄芪皂苷组、黄芪黄酮+葛根黄酮组、黄芪皂苷+葛根黄酮组、黄芪黄酮+黄芪皂苷+葛根黄酮组,正常组11只,其余各组15只。除正常组外,其余各组一次性腹腔注射2%STZ(46 mg/kg)造模,造模同日给药,正常组、模型组分别予蒸馏水10 m L/kg,其他给药组分别予金芪降糖片混悬液1.47 g/kg、黄芪黄酮0.039 g/kg、黄芪皂苷0.104 g/kg、葛根黄酮0.036 g/kg、黄芪黄酮+黄芪皂苷0.143 g/kg、黄芪黄酮+葛根黄酮0.075 g/kg、黄芪皂苷+葛根黄酮0.140 g/kg、黄芪黄酮+黄芪皂苷+葛根黄酮0.179 g/kg,连续灌胃30d。生化法检测血糖、TG、CHO含量,ELISA法检测APN、LEP、TNF-α、GLUT-4含量,Real-time PCR法检测Chemerin、Chem R23、AMPK、GLUT-4、β-actin m RNA相对表达量。实验三:3T3-L1前脂肪细胞分别予50μM、100μM、200μM、400μM毛蕊异黄酮葡萄糖苷(简称:毛蕊异黄酮苷)完全培养基,0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM葛根素完全培养基培养24 h、48 h、72 h,MTT法检测细胞存活率,筛选出最适的给药时间与给药浓度。将筛选出的毛蕊异黄酮苷100μM、200μM、400μM与葛根素2μM、4μM一一配伍,培养3T3-L1前脂肪细胞48 h。MTT法检测细胞存活率,筛选出最适的给药浓度。3T3-L1前脂肪细胞分为5组,正常组全程予完全培养基,模型组予完全培养基,毛蕊异黄酮苷组予200μM毛蕊异黄酮苷,葛根素组予4μM葛根素,单体配伍组予200μM毛蕊异黄酮苷+4μM葛根素,培养48 h。模型组予诱导液A(1μg/m L IBMX、1μM DEX、1μg/m L INS+完全培养基)、其余各组分别予治疗药物+诱导液A,培养48 h。模型组予诱导液B(1μg/m L INS+完全培养基)、其余各组分别予治疗药物+诱导液B,培养48h,换液2次。油红O检测脂肪细胞分化成脂,ELISA法检测TG、CHO、APN、LEP、TNF-α含量,流式细胞术检测2-NBDG含量,免疫荧光法检测GLUT-4,Western Blot法检测AMPK、P-AMPK、β-actin含量。结果:第一部分:文献研究1.脾与消渴的关系:消渴的病因与脾虚有关,其病机多与脾气虚不能布散津液、脾阴不足有关。消渴的治疗可从脾入手,选用益气健脾的方药。2.脾与膏脂的关系:现代解剖的脂肪、肌肉皆属于中医“肌肉”范畴,统归于脾。膏脂的形成与饮食五谷壅滞损伤脾胃,脾气虚或脾阳不足,不能输布精微有关,治疗时选用健脾药物。第二部分:实验研究体内实验(论文一、二):1.对糖尿病大鼠血糖、血脂的影响:(1)对糖尿病大鼠血糖的影响:造模第30d,与正常组比较,模型组大鼠血糖显著增高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,黄芪、葛根、饮片配伍、黄芪黄酮能明显降低糖尿病大鼠血糖,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)对糖尿病大鼠血脂的影响:与正常组比较,模型组大鼠血清CHO、TG水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,黄芪、葛根、饮片配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮、黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、黄芪皂苷与葛根黄酮配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能够降低糖尿病大鼠血清CHO、TG(黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍除外)含量,差异有统计学意义(P<0.05)。在饮片层次,黄芪与葛根能够协同降低TG,效果最佳;在组分层次,单用黄芪皂苷降低CHO水平最佳,单用黄芪黄酮降低TG的作用最优。2.对糖尿病大鼠脂肪因子的影响:(1)对糖尿病大鼠APN、LEP、TNF-α的影响:与正常组比较,模型组大鼠APN、LEP表达明显降低,模型组TNF-α水平明显上高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,黄芪、饮片配伍、黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、黄芪皂苷与葛根黄酮配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能够显著升高糖尿病大鼠脂肪组织APN水平;黄芪、饮片配伍能够提高糖尿病大鼠脂肪组织LEP表达量;黄芪、饮片配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮、黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、黄芪皂苷与葛根黄酮配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能够显著降低糖尿病大鼠脂肪组织TNF-α水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。在饮片层次,单用黄芪降低TNF-α的效果优于两药合用。在组分层次,黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍协同降低TNF-α水平,效果最佳。(2)对糖尿病大鼠Chemerin、Chem R23 m RNA的影响:与正常组比较,模型组大鼠Chemerin、Chem R23 m RNA相对表达量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,黄芪、葛根、黄芪黄酮、黄芪皂苷、黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍能够减少糖尿病大鼠脂肪组织Chemerin m RNA相对表达量;黄芪、葛根、饮片配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮、黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、黄芪皂苷与葛根黄酮配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能够降低糖尿病大鼠脂肪组织Chem R23 m RNA相对表达量,差异具有统计学意义(P<0.05)。在饮片层次,单用黄芪降低Chem R23 m RNA相对表达量的效果最佳。在组分层次,单用黄芪黄酮降低糖尿病大鼠脂肪组织Chemerin、Chem R23 m RNA相对表达量的效果最佳。3.对糖尿病大鼠AMPK、GLUT-4的影响(1)对糖尿病大鼠AMPK、GLUT-4 m RNA的影响:与正常组比较,模型组大鼠AMPK、GLUT-4 m RNA水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,黄芪、葛根、单体配伍、黄芪黄酮、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能够升高糖尿病大鼠AMPK m RNA水平;黄芪、葛根、饮片配伍、黄芪黄酮、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能够升高糖尿病大鼠GLUT-4 m RNA水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。在饮片层次,黄芪与葛根能够协同增加GLUT-4 m RNA,效果最佳。在组分层次,单用黄芪黄酮增加糖尿病大鼠脂肪组织AMPK、GLUT-4 m RNA相对表达量的效果最好。(2)对糖尿病大鼠GLUT-4含量的影响:与正常组比较,模型组大鼠GLUT-4水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,黄芪、单体配伍、黄芪黄酮、黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、黄芪皂苷与葛根黄酮配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能升高糖尿病大鼠脂肪组织GLUT-4水平,差异有统计学意义(P<0.05)。在饮片层次,黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍增加糖尿病大鼠脂肪组织GLUT-4水平的效果最佳。体外实验:1.对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响:(1)对3T3-L1前脂肪细胞成活率的影响:培养48h,100μM、200μM、400μM毛蕊异黄酮苷促进3T3-L1前脂肪细胞增殖的效果佳;2μM、4μM葛根素能够促进3T3-L1前脂肪细胞增殖;200μM毛蕊异黄酮苷与4μM葛根素合用能够促进3T3-L1前脂肪细胞增殖。(2)对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响:显微镜下观察,毛蕊异黄酮苷组、葛根素组、单体配伍组内可见有大量的成熟脂肪细胞,数量较正常组和模型组明显增多。油红O吸光度结果显示,与正常组比较,模型组没有统计学差异(P≥0.05)。与模型组比较,毛蕊异黄酮苷、葛根素、单体配伍能显著升高油红的吸光度,差异具有统计学意义(P<0.05),毛蕊异黄酮苷与葛根素能够协同促进脂肪细胞形成,效果最佳。2.对IR脂肪细胞糖、脂的影响:(1)对IR脂肪细胞摄取2-NBDG的影响:与正常组比较,模型组细胞内2-NBDG的含量减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,毛蕊异黄酮苷、单体配伍能够显著提升IR脂肪细胞内2-NBDG的含量,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)对IR脂肪细胞CHO、TG的影响:与正常组比较,模型组细胞内CHO、TG水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,毛蕊异黄酮苷、葛根素、单体配伍能够显著降低IR模型脂肪细胞的CHO、TG水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.对IR脂肪细胞脂肪因子的影响:与正常组比较,模型组细胞内APN、LEP水平显著降低,模型组TNF-α水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,毛蕊异黄酮苷、葛根素、单体配伍能够显著升高IR模型脂肪细胞APN、LEP水平,降低TNF-α水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。毛蕊异黄酮苷、葛根素能够协同增加APN、LEP水平,协同降低TNF-α水平,效果最佳。4.对IR脂肪细胞AMPK、GLUT-4的影响:(1)对IR脂肪细胞AMPK的影响:与正常组比较,模型组细胞内p-AMPK/AMPK水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,毛蕊异黄酮苷、葛根素、单体配伍能够显著升高IR模型脂肪细胞p-AMPK/AMPK水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)对IR脂肪细胞GLUT-4的影响:与正常组比较,模型组细胞内GLUT-4水平明显减少。毛蕊异黄酮苷、葛根素、单体配伍能增加IR模型脂肪细胞的GLUT-4含量。结论:1“脾虚”是消渴发病、膏脂形成的主要病机,可从脾论治消渴。2黄芪黄酮、毛蕊异黄酮苷是黄芪降低血糖、降低血脂(CHO、TG)的有效成分。3葛根黄酮、葛根素是葛根降血脂(CHO、TG)的有效成分。4黄芪与葛根配伍、毛蕊异黄酮苷与葛根素配伍能够降低血糖,合用的效果最佳;其降糖的作用机制可能与调节脂肪因子、介导AMPK/GLUT-4转导有关。5黄芪与葛根配伍、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、毛蕊异黄酮苷与葛根素配伍能够降低CHO、TG,合用降血脂的效果最佳(黄芪黄酮与葛根黄酮配伍除外);其降脂的作用机制可能与调节脂肪因子、介导AMPK转导有关。