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藤茶(vine tea)是指显齿蛇葡萄(Ampelopsis rossedenttata)的嫩茎叶部位,这是一种葡萄科(Vitaceae)蛇葡萄属(Ampelopsis Michx.)的植物。茶文化在中国有悠久的历史,代用茶在世界范围受人们喜爱的程度也很高,因而研究藤茶的生理功能及机理有实际的意义。藤茶的提取物中黄酮类物质占比最高,其中二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)含量也相对其它活性成分更高。本课题通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)建立的RAW264.7巨噬细胞体外炎症模型和葡聚糖硫酸钠(sodiumdextran sulfate,DSS)建立的小鼠溃疡性结肠体内炎症模型,来探究藤茶提取物(AGM)与DMY的抗炎功效和机理。本实验通过95℃热水浸提120 min,过滤后冷冻干燥得到AGM,提取率为:40.78%,并测定DMY含量为:22.09%。1.AGM抗炎作用及分子机制用AGM(1g/kg/day)悬浊液灌胃小鼠来探究它们对体内结肠炎模型小鼠的宏观表型以及组织损伤的影响。经统计表明:AGM小鼠较损伤组活跃,便血情况明显改善,疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分明显下降,结直肠状态也得到改善。病理组织学分析发现:AGM保护组小鼠较DSS组小鼠炎性细胞浸润情况缓解,黏膜和隐窝结构相对完整,排列较为整齐有序。结肠组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、环氧化酶-2(cyclooxygenase 2,COX-2)白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和诱导型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase,iNOS)在损伤组的结肠组织中蛋白表达量分别提高至对照组的2.5、4.8、7.5、4.5和3倍。而AGM保护组COX-2和IL-1β都趋于CON的表达量,IL-6和TNF-α都下降至约为DSS组的一半,有显著性差异。AGM体外细胞实验结果表明:LPS组中iNOS、COX-2、IL-1β、TNF-α和IL-6这些炎症因子mRNA表达上调,分别是对照组的4.3、5.8、3.0、8.0和2.6倍;而AGM25μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL三组浓度保护组这些炎症因子mRNA表达量都明显下降,且存在剂量依赖性。LPS诱导组较对照组的炎性细胞因子蛋白水平的表达明显上调,而AGM给药组炎性细胞因子蛋白水平表达量呈浓度依赖性下降。其中100μg/mL的AGM给药组IL-1β、TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS的蛋白水平表达分别下调了66.7%、80.6%、88.8%、61.9%和42.6%。进一步实验结果表明:AGM保护后能够调控核转录因子(nuclear transcription factor-κB,NF-κB/p65)和(activator protein-1,AP-1/c-Jun)转录活性和RAW264.7细胞中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路关键靶分子磷酸化水平。2.DMY抗炎作用及分子机制用DMY(100 mg/kg/day)悬浊液灌胃小鼠来探究它们对体内结肠炎模型小鼠的宏观表型以及组织损伤的影响。经统计表明:DMY能够显著缓解结肠炎小鼠DAI评分和病理进程。DMY抗炎评估中,DSS诱导的结肠炎小鼠中IL-6的表达上调最多,达到了正常小鼠的8.3倍左右,而在饮食DMY之后,IL-6的表达量极显著下降,表达量接近正常小鼠的水平。DSS组iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的表达量均上升至CON组的4-5倍左右,而在饮食DMY之后都得到了明显的抑制,表达量明显下降,都趋于CON的表达量。DMY的体外细胞实验结果表明:LPS组中iNOS、COX-2、IL-1β、TNF-α和IL-6这些炎症因子mRNA表达上调,分别是对照组的3.2、7.2、4.0、4.5和2.3倍;另外RT-PCR结果显示,DMY保护组使LPS组中上调的toll受体4(toll-like receptor4,TLR4)以及lncRNAH19的mRNA表达下调。LPS诱导组较对照组的炎性细胞因子蛋白水平的表达也明显上调,而DMY保护组炎性细胞因子蛋白水平表达量呈浓度依赖性下降。其中50 μmol/L的DMY保护组COX-2、IL-1β、TNF-α、IL-6和iNOS的蛋白水平表达分别下调了81.4%、74.5%、75.2%、87.5%和31.1%。进一步实验结果表明:DMY保护组同样能够调控NF-κB和AP-1转录活性和MAPK通路关键靶分子磷酸化水平。除此以外,MAPK抑制剂实验进一步确定DMY(25μmol/L)抗炎与MAPK通路的关系。结果表明:抑制剂组细胞中p38、JNK及ERK1/2磷酸化以及IL-6蛋白表达量较LPS组明显下调。而DMY+抑制剂组的MAPK磷酸化水平和IL-6炎症因子的蛋白含量都较抑制剂组进一步下降。综上可得:AGM可能调控细胞MAPK信号通路来抑制通路下游核转录因子活性,从而降低炎症因子表达量,达到抗炎的效果。DMY可能通过TLR4-MAPK/H19来抑制转录因子活性进而调节炎症因子表达来发挥抗炎作用。