糖类具有很多重要的生物学作用,比如作为细胞的结构组分、细胞间相互作用、介导和调控细胞黏附等。常用的糖类化合物合成方法主要有化学法和酶法。采用化学法合成糖链,为了控制构型和区域选择性,需要采用多步的保护和去保护步骤。相比较而言,酶法合成糖类化合物由于酶本身的性质从而具有较强的立体选择性和区域选择性。在酶法合成糖类化合物的过程中,糖基转移酶和糖苷水解酶被广泛应用。糖基转移酶具有严格的立体选择性和区域选择性,但是需要使用价格昂贵的糖基供体NDP-糖苷,虽然近年来一釜多酶反应体系可以比较有效地解决糖基供体的合成问题,但是多种酶的重组表达和分离纯化对于利用糖基转移酶大量合成糖类化合物目前还是存在着些许限制。与糖基转移酶相比,糖苷水解酶催化的转糖基反应所使用的糖基供体如乳糖、蔗糖、硝基苯糖苷等价格便宜且容易获取,酶的底物的适应性广泛,可以非保护的天然糖以及修饰糖作为底物,且反应过程中不需要其他辅助因子的参与。糖苷水解酶的来源十分丰富,酶的性质稳定且表达纯化简单,较易获得,因此糖苷水解酶被广泛应用于糖类化合物的合成。但糖苷酶催化的合成反应也存在一定的局限,主要表现在催化反应的产率不高,这主要是由于糖苷水解酶的本身性质决定的,合成的转糖基产物又可以被糖苷水解酶作为底物进行二次水解。因此可采用多种分子生物学手段如定点突变、随机突变、半理性设计等来对糖苷水解酶进行分子改造,降低其水解效率同时保留其转糖基活性,从而提高糖苷水解酶合成糖类化合物的产率。本论文从利用糖苷酶合成糖苷类化合物出发,研究工作分别针对α-L-岩藻糖苷酶和α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶开展:（一）、α-L-岩藻糖苷酶的基因挖掘、分子改造和转糖基作用Fuc-GlcNAc作为一类岩藻糖苷化合物,是母乳寡糖、Lewis血型抗原以及细胞表面糖蛋白受体的重要组成结构单元,在婴幼儿配方奶粉、益生元、制药领域有着很好的应用前景。Fuc-α-1,6-GlcNAc能够抑制肠致病性大肠杆菌（enteropathogenic Escherichia coli）对人结肠癌细胞（HT29）的粘附;Fuc-α-1,3-GlcNAc能够作为益生元,促进乳杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）的生长。α-L-岩藻糖苷酶是一类广泛存在于生物体内的外切糖苷水解酶,能够将L-岩藻糖苷残基从糖链的非还原末端水解下来,其主要分布于GH29和GH95两个糖苷酶家族,根据水解底物特异性的不同,GH29家族又进一步分为GH29A和GH29B两个亚家族。由于GH29A亚家族的岩藻糖苷酶可以水解人工底物pNP-α-Fuc,该家族的酶被广泛的应用于岩藻糖苷化合物合成。本论文首先对脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis NCTC9343）基因组和CAZy数据库（http://www.cazy.org）中α-L-岩藻糖苷酶基因进行分析,发现脆弱拟杆菌基因组上拥有13个α-L-岩藻糖苷酶基因,其中9个属于GH29家族,4个属于GH95家族。通过对9个GH29家族的α-L-岩藻糖苷酶进行进化树分析后,发现其中5个α-L-岩藻糖苷酶属于GH29A亚家族,4个α-L-岩藻糖苷酶属于GH29B亚家族。多序列比对结果显示,GH29A亚家族亲核体位点氨基酸残基保守,酸碱催化位点氨基酸残基不保守,GH29B亚家族的亲核体位点氨基酸残基和酸碱催化氨基酸残基都保守。由于GH29A亚家族的岩藻糖苷酶可以水解人工底物pNP-α-Fuc,具有合成岩藻糖苷化合物的巨大潜力,本论文对脆弱拟杆菌来源的5个GH29A亚家族的α-L-岩藻糖苷酶BF0028（Uniprot accession No.Q5LJ69）、BF0810（Uniprot accession No.Q5LH32）、BF1796（Uniprot accession No.Q5LEF6）、BF3242（Uniprot accession No.Q5LAD6）和BF3591（Uniprot accession No.Q5L9F5）进行了分子克隆,其中4个α-L-岩藻糖苷酶（BF0028、BF0810、BF3242和BF3591）在大肠杆菌中成功表达,BF1796未成功表达推测可能是由于其缺乏一个C端结构域。然后对这4个酶的水解底物的特异性、动力学参数以及转糖基活性进行了研究,发现4个酶只对pNP-α-Fuc具有水解活性,对其他的11种硝基苯糖苷均没有水解活性,并且这4个酶对天然糖链上的岩藻糖苷键的水解活性也各不相同,BF0028能够水解α-1,2和α-1,3连接的岩藻糖,BF0810只对人工底物有水解活性,对天然糖链没有水解活性,BF3242和BF3591都能够水解α-1,2、α-1,3、α-1,4和α-1,6连接的岩藻糖,BF3242对二糖的水解活性明显高于三糖,BF3591则对α-1,3键型表现出更高的水解活性。对4个酶动力学参数Km和kcat的研究表明,BF3242对底物pNP-α-Fuc的亲和能力最强（Km为0.23 mM）,BF0028对底物pNP-α-Fuc的亲和能力最弱（Km为14.95 mM）,对酶的催化效率而言,BF3242的催化效率最高(kcat为237.19 S-1·mM-1,BF3591 的催化效率最低（kcat为2.52 S-1·mM-1）。当以pNP-α-Fuc作为供体,以GlcNAc、葡萄糖、半乳糖、乳糖、纤维二糖和麦芽糖为受体进行转糖基活性筛选时,只有α-L-岩藻糖苷酶BF3242能够以pNP-α-Fuc为供体,GlcNAc、葡萄糖和麦芽糖为受体进行转糖基反应。当以pNP-α-Fuc为转糖基供体,以GlcNAc为转糖基受体时,BF3242能够合成两种产物。酶学性质研究发现,BF3242最适温度为45℃,温度低于45℃时保持稳定;在pH为5.5到7.5范围内有很高的活性,pH 5.0到11.0有很好的稳定性。同时,重组酶BF3242活性受金属离子影响明显,EDTA、Hg2+、Ag+、Ca2+和Ni2+能够很明显的抑制酶的活性,K+对酶活有少许的促进作用。通过对转糖基反应的底物浓度、温度、pH、时间的优化,在0.05U/ml的酶量、20mM的pNP-α-Fuc、500mM的GlcNAc、50mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5）、37℃的反应条件下反应45 min时,实现了Fuc-α-1,3/1,6-GlcNAc的最高产率（79%）,产物中Fuc-α-1,3-GlcNAc和Fuc-α-1,6-GlcNAc的产率各为25.5%和53.5%,产物利用质谱与核磁共振波谱进行了结构鉴定,并且发现了在不同的温度下两种产物所占比例有很大的不同:当温度由25℃升高到37℃时,BF3242生成Fuc-α-1,6-GlcNAc的产量占总产量的比例由88%降低到68%,当温度由37℃升高到50℃时,BF3242生成Fuc-α-1,3-GlcNAc的产量占总产量的比例由32%提高到68%。由于BF3242催化的转糖基反应生成的产物为α-1,3和α-1,6两个同分异构体且每一个单一组分的产率受反应温度的影响,因此本论文首先采用半理性设计的手段对酶进行了分子改造。第一轮分子突变以来自B.thetaiotaomicron ATCC29148的岩藻糖苷酶BT1470（PDB entry 4WSJ）为模板进行BF3242的同源模建,并用SYBYL-X 1.1对模型进行修正;进一步利用主成分分析方法分析对BF3242进行分子动力学分析,发现BF3242酶分子中的Loop-4（His220-Ser245）在不同的温度（300 K和350 K）下摆动幅度有明显的差异,推测Loop-4可能会对酶在不同温度下产生同分异构体的比例不同产生影响。采用大引物易错PCR对α-L-岩藻糖苷酶BF3242的Loop-4结构（His220-Ser245）进行了随机突变建立了500个克隆的突变库,筛选获得4个转糖基反应α1-3键型区域选择性专一的突变酶RM100、RM179、RM342和RM378,测序结果显示共有6个点突变:F232Y和L244F（RM100）、S245L（RM179）、D235E和N240G（RM342）、P237V（RM378）。分别进行了这6个突变位点的单点定点突变,筛选后发现其中4个点突变（D235E、P237V、L244F和S245L）对BF3242转糖基反应的区域选择专一性具有正向作用,其中L244F的作用最为明显。然后对位点Leu244进行饱和突变,筛选获得一个区域选择专一性明显提高的单点突变酶BF3242 L244H。BF3242 L244H以20 mM的pNP-α-Fuc为供体,以500 mM的GlcNAc为受体,转糖基产率为69%,产物中Fuc-α-1,3-GlcNAc的含量为97%。虽然BF3242 L244H转糖基反应的区域选择专一性明显提高,但其转糖基反应的产率和原始酶相比有所下降,因此在此基础上进行第二轮BF3242 L244H的理性分子突变以提高其转糖基活性,利用分子对接技术,得到BF3242 L244H在受体（GlcNAc）周围可能有相互作用的5个正位点氨基酸残基Gly35、Glu36、Gly262、Met263和Gly265,然后对这5个正位点氨基酸残基进行了改变极性和位阻的定点突变研究。通过对所设计的5个突变酶BF3242 L244H-G35S、BF3242 L244H-E36S、BF3242 L244H-G262S、BF3242 L244H-M263C 和 BF3242 L244H-G265S 转糖基活性筛选,发现 BF3242 L244H-M263C的转糖基产率为76%,其中合成Fuc-α-1,3-GlcNAc的产率为73%,合成Fuc-α-1,6-GlcNAc的产率为3%,总产率比BF3242 L244H提高7%。进一步对筛选到的BF3242 L244H中的重要正位点Met263进行饱和突变,最终获得了突变酶BF3242 L244H-M263T能够以83%的产率合成Fuc-α-1,3-GlcNAc,以2%的产率合成Fuc-α-1,6-GlcNAc,即其合成Fuc-α-1,3-GlcNAc的区域选择性为98%。动力学参数研究发现,BF3242 L244H和BF3242 L244H-M263T的Km值分别为0.31mM和0.33 mM,较BF3242 WT的0.27 mM无显著差异,但是BF3242 L244H和BF3242 L244H-M263T的kcat值分别为46.94 S-1 和21.33 S-1,相较于BF3242 WT的64.04 S-1分别降低了 1.4和3倍。酶学性质研究发现,BF3242 WT和BF3242 L244H在pH 5.0～9.0范围内稳定,而BF3242L244H-M263T在pH5.5～9.0范围内稳定;三个酶反应的最适pH范围分别为7.0、7.0和7.5。BF3242 WT和BF3242 L244H在40℃以下保温时稳定,而BF3242 L244H-M263T在37℃以下保温时稳定;三个酶反应的最适温度范围分别为40℃、37℃和37℃。运用分子动力学分析了原始酶和突变酶区域选择性改变的结构基础,发现在BF3242 L244H中,L244H突变使得整个Loop-4的RMSF值减小,表明该loop的摆动幅度减小,从而使酶的区域选择性更加专一;在BF3242 L244H-M263T中,Met263位于Loop-5结构,该结构N端位于催化腔内且位于底物的正位点附近,M263T突变影响了酶的转糖基活性。（二）、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶:分子改造和转糖基作用α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶分为外切α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶和内切α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶两种类型。外切α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶（exo-α-N-acetylgalactosaminidase,EC.3.2.1.49）可以催化非还原端末端的α-N-乙酰氨基半乳糖苷的水解,分别隶属于糖苷酶GH27家族、GH36家族、GH109家族和GH129家族。并且内切α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶（endo-α-N-acetylgalactosaminidase,EC.3.2.1.97）,能够对O-糖链中Gal-β-1,3-GalNAc或者GlcNAc-β-1,3GalNAc与丝氨酸或者苏氨酸的连接键进行水解,隶属于GH101家族。本课题组前期获得了一种新的来源于长双歧杆菌（Bifidobacterium longum JCM1217）的α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶NagBl（GenB ank accession No.BAJ66456）,该酶表现出外切和内切α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶活性,能够分别以 GalNAc-α-pNP 和 Gal-β-1,3-GalNAc-α-pNP 为供体,以 Ser 和 Thr 为受体,合成GalNAc-α-Ser（产率为48%）和GalNAc-α-Thr（产率为27%）,以及 Gal-β-1,3-GalNAc-α-Ser（产率为 74%）和 Gal-β-1,3-GalNAc-α-Thr（产率为59%）,是目前已报道的其它来源α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶中的最高水平。但NagBl 合成 GalNAc-α-Ser 和 GalNAc-α-Thr 的产率相较于 Gal-β-1,3-GalNAc-α-Ser和 Gal-β-1,3-GalNAc-α-Thr 仍较低。为 了提高 NagBl 合成 GalNAc-α-Ser 和GalNAc-α-Thr的产率,本论文将产物分子GalNAc-α-Ser或者GalNAc-α-Thr与酶分子进行了分子对接,选择first shell中+1位点附近即受体周围的氨基酸残基R550、Y554和D558位点进行改变极性和位阻的定点突变研究,突变酶设计为NagBl R550H、NagBl Y554F 和 NagBl D558A,转糖基活性筛选后发现 NagBl D558A明显提高了转糖基产率,对GalNAc-α-Ser转糖基产率由48%提高到86%,对GalNAc-α-Thr的产率由27%提高到59%。考虑到苏氨酸的结构比丝氨酸的结构多了一个甲基,本论文对Asp558位点又进行了侧链基团比较小极性也比较小的氨基酸残基替换定点突变研究,突变酶设计为NagBl D558G、NagBl D558S和NagBl D558T,转糖基活性筛选后发现NagBl D558S转糖基合成GalNAc-α-Ser和GalNAc-α-Thr的产率分别为89%和64%,在所设计的突变酶中是最高的。酶学性质研究发现,NagBl WT在50℃以下保持稳定,NagBl D558S在55℃以下保持稳定,NagBl WT最适温度为60℃,NagBl D558S的最适温度为55℃。NagBl WT在pH 4.5～9.5范围内稳定,NagBl D558S在pH 5.5～7.0范围内稳定。NagBl WT的反应最适pH为4.0,而NagBl D558S的反应最适pH为5.5。通过对底物浓度、pH、温度以及反应时间的优化,NagBl D558S在起始底物浓度为400mM的 Ser 或者 Thr,20 mM 的pNP-α-GalNAc,酶浓度 0.15 U/mL,在 50 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5.8）中40℃反应,能够以较高的产率合成GalNAc-α-Ser和GalNAc-α-Thr,两种产物的产率分别为92%和85%。本论文进一步采用NagBl D558S催化的转糖基反应分别合成了 20mg GalNAc-α-Ser和GalNAc-α-Thr,然后结合一步化学反应,将单糖氨基酸α-氨基用Fmoc进行保护,化学酶法两步合成了 GalNAc-α-Ser-Fmoc和GalNAc-α-Thr-Fmoc,反应的总产率分别为74%和71%,并对产物进行了质谱及核磁共振波谱的结构鉴定,这两种产物可应用于多肽的固相合成,为糖肽的批量制备奠定了物质基础。另外对NagBl D558S以GalNAc-α-pNP为供体对短肽的转糖基活性研究发现,NagBl D558S只能对N端为Ser或者Thr的短肽具有转糖基活性合成糖肽,并且N端第二位氨基酸残基会对该酶的转糖基活性产生影响,位阻较大的氨基酸残基如谷氨酰胺（Q）、组氨酸（H）、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）会降低该酶的转糖基效率,进一步研究发现该酶可以识别五肽、六肽、十二肽和二十肽为受体进行转糖基反应,合成糖肽的产率为五肽（23%）、六肽（13%和 16%）、十二肽（28%）和二十肽（31%）。NagBl D558S 还能以Gal-β-1,3-GalNAc-α-pNP为供体对上述所用的短肽具有转糖基活性,以Gal-β-1,3-GalNAc-α-pNP为供体对不同短肽受体进行转糖基的趋势包括N端第二位氨基酸残基以及肽段长度均与以GalNAc-α-pNP为供体时基本相同。本论文同时对已报道的来自于双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum JCM1254）的α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶 NagBb（GenBank accession No.BAL14929）开展了分子突变及转糖基活性研究。据报道,NagBb合成GalNAc-Ser的产率为6.3%,显著低于本课题组前期获得的α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶NagBl的59%。序列相似性分析发现NagBl和NagBb氨基酸残基序列相似性为77%且在催化结构域中仅有53个氨基酸残基不同,其中的31个氨基酸残基位于loop结构上。通过分子对接手段,对NagBl和NagBb催化结构域中位于loop结构且处于first shell和second shell的氨基酸残基进行分析,发现Ser283、Phe284、Met397和Met560四个差异位点与GalNAc-α-Ser的距离在10 （?）之内,推测它们可能会对转糖基活性产生影响。本论文以高转糖基活性的NagBl作为模板,对NagBb的四个位点进行定点突变（S283Y、F284Y、M397R 和 M560V）。在 0.16 mg/mL 酶与 20 mM供体GalNAc-α-pNP和400 mM受体Ser,在37℃的反应条件下,NagBb F284Y的转糖基产率大于NagBb WT,合成GalNAc-α-Ser产率为83%,是NagBb WT产率（40%）的2.1倍。然后对Phe284位点进行了饱和突变和转糖基活性筛选,发现NagBb F284S的转糖基合成GalNAc-α-Ser产率（90%）最高,是NagBb WT催化的GalNAc-α-Ser产率（40%）的2.3倍。酶学性质研究发现,NagBb WT在37℃以下保温时稳定,NagBb F284S在40℃以下保温时稳定;NagBb WT的反应最适温度为45℃,NagBb F284S的反应最适温度为50℃;NagBb WT和NagBb F284S在pH 6.0～10.0范围内稳定;NagBb WT的反应最适pH为6.0,而NagBb F284S的反应最适pH为6.0。通过蛋白质结构模拟显示NagBb F284S的催化腔口比NagBb WT变得更宽,NagBb F284S转糖基活性提高的原因可能284位点Phe替换成Ser后位阻变小,造成底物或转糖基产物更容易进入反应活性中心或更容易与酶脱离,降低水解活性,提高转糖基活性。本论文的研究结果为糖苷酶法合成糖苷类化合物提供了多种新的工具酶,并为糖苷酶的转糖基区域选择性和转糖基活性提高的分子改造提供了新的思路。