【摘 要】
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虫草素是蛹虫草的主要活性成分,具有抗肿瘤、抗病毒、抑制炎症等功能,具有广阔的应用前景。虫草素虽然可以通过化学合成法生产,但是原料成本高、工艺复杂、操作繁琐等缺点限制了其应用,目前,主要采用蛹虫草菌液体发酵法来获得虫草素。现阶段蛹虫草菌的虫草素发酵产量及生产强度仍然较低,难以满足工业生产要求,亟需解析虫草素代谢机制,明确代谢调控节点,进而基于代谢工程改造提高虫草素生产能力。本研究以蛹虫草菌Cordy
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虫草素是蛹虫草的主要活性成分,具有抗肿瘤、抗病毒、抑制炎症等功能,具有广阔的应用前景。虫草素虽然可以通过化学合成法生产,但是原料成本高、工艺复杂、操作繁琐等缺点限制了其应用,目前,主要采用蛹虫草菌液体发酵法来获得虫草素。现阶段蛹虫草菌的虫草素发酵产量及生产强度仍然较低,难以满足工业生产要求,亟需解析虫草素代谢机制,明确代谢调控节点,进而基于代谢工程改造提高虫草素生产能力。本研究以蛹虫草菌Cordyceps militaris FFCC 5101深层液体发酵体系为研究对象,探究了葡萄糖与木糖两种碳源发酵体系蛹虫草菌的虫草素发酵差异,进而基于本研究构建的适用于蛹虫草菌的代谢组学分析技术,对葡萄糖与木糖两种碳源发酵体系蛹虫草菌胞内、胞外代谢物进行分析,探究代谢通量变化与虫草素积累的关联。主要研究结果如下:（1）比较了葡萄糖与木糖两种碳源体系的蛹虫草菌虫草素发酵,研究结果表明:蛹虫草菌能够利用葡萄糖与木糖发酵生产虫草素,当利用单一碳源时,葡萄糖与木糖的最适浓度分别为30 g/L和20 g/L,虫草素发酵产量分别是144.63±19.48 mg/L和50.61±0.66 mg/L,其中葡萄糖有利于菌体生长及虫草素积累;在葡萄糖-木糖两阶段液体发酵体系中,基于木糖代谢的虫草素生产强度显著提高,由2.53±0.03 mg/L/d提高到3.55±0.09 mg/L/d;利用玉米芯酶解液进行蛹虫草菌深层液体发酵,虫草素产量为25.53±3.27mg/L,初步实现了以玉米芯为原料发酵生产虫草素。（2）优化了代谢组学分析中胞内代谢物提取、代谢物衍生以及GC-MS分析等过程,构建了适用于蛹虫草菌代谢物的分析方法。优化后代谢物分析主要流程为:菌丝体经代谢淬灭、破碎之后,利用21%甲醇溶液提取胞内代谢物质,经冷冻干燥后溶解于40μL甲氧胺盐试剂,而后利用60μL BSTFA（含有1%TMCS,v/v）衍生处理,收集上清用于GC-MS分析,其升温程序为:初温100℃保持2 min,以2℃/min升温到320℃保持25 min。（3）以利用葡萄糖/木糖为碳源的蛹虫草菌液体发酵为研究对象,代谢物分析结果表明,与虫草素生物合成相关的代谢途径主要有糖酵解途径、TCA循环、磷酸戊糖途径,氨基酸代谢途径以及多不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸代谢途径。苹果酸与柠檬酸作为TCA循环的代谢物,其胞内含量变化与虫草素产量呈负相关;甘露醇、阿拉伯糖醇等糖醇类物质影响磷酸戊糖途径,其含量变化与虫草素产量呈正相关;丙氨酸、甘氨酸等氨基酸类物质主要为提供细胞生长提供营养物质,十六烷酸、十八烷酸等饱和脂肪酸与细胞生长密切相关,其含量变化与蛹虫草菌的生物量变化呈正相关。本研究通过比较葡萄糖与木糖两种碳源对蛹虫草菌C.militaris FFCC 5101代谢途径的差异,有助于进一步解析蛹虫草菌发酵生产虫草素的代谢网络,进而明确调控虫草素合成的关键节点。
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