论文部分内容阅读
背景
非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liverdisease，NAFLD)是全球重大公共卫生事件，严重影响了约10亿人口的身体健康。至今尚未明确其具体的发病机制及临床有效治疗药物，因此深入探讨NAFLD的发病机理，寻找可能的潜在干预治疗靶点，将会为临床有效防治NAFLD提供科学依据。
自噬是一种普遍存在的生理过程，是机体细胞为适应恶劣环境及对抗各种应激做出的一种自我保护反应，自噬也参与了众多疾病的发生发展。最新研究进展表明代谢性疾病包括NAFLD等脂肪堆积过程中的脂代谢紊乱与自噬障碍密切相关，激活自噬能够改善脂质代谢紊乱。Lipophagy是一种选择特异性自噬，是脂滴(Lipid droplets，LDs)和胆固醇(Cholesterol，CHOL)被自噬体选择性吞噬并传递给溶酶体，融合后在酸性脂肪酶和水解酶相互作用下将LDs分解为甘油和游离脂肪酸(Free fatty acids，FFA)的一种细胞内降解脂肪的途径，以此去除多余的脂质来保护细胞免受脂毒性侵害。已有研究表明，Lipophagy能有效降解LDs来调节细胞内的脂代谢水平，改善肥胖症的严重程度。但Lipophagy是否能够作为防治NAFLD的一个潜在干预靶点仍不清楚。运动和饮食调节是代谢性相关疾病的常用干预手段，那么它们是否能够通过调控Lipophagy来改善NAFLD，其内在的分子机制如何，以及二者的干预机制是否有交集等仍不清楚。
为了验证上述这些问题，我们体内采用由高脂膳食(High fat diet，HFD)诱导大鼠的NAFLD模型和体外采用的FFA诱导的细胞脂肪沉积模型，从对Lipophagy的调控机制角度探讨运动和饮食调节对HFD引起的NAFLD以及肝脏衰老的改善作用及机制，为将来临床制定NAFLD及其引起的相关疾病的防治策略提供实验室依据。
目的
通过HFD诱导的大鼠NAFLD模型及FFA诱导的细胞脂肪沉积模型，研究运动和饮食调节对HFD引起NAFLD及肝脏衰老的保护作用，并阐明Lipophagy及其上游的信号通路在此过程中的作用和机制。
方法
1．SD大鼠给予HFD3个月建立动物NAFLD模型，建模成功后，设对照组，将动物分为Chow、HFD、HFD+Exercise、HFD-Chow和HFD-Chow+Exercise五组，其中HFD-Chow为由高脂饲料改为常规普通饲料，Exercise为按照设计完成规定的运动，继续喂养2个月。
2．对肝组织切片进行HE和油红O染色以观察病理学改变及LDs累积情况。
3．采用试剂盒检测肝组织切片SA-β-gal染色及酶活性。
4．采用试剂盒检测肝组织甘油三酯(Triglyceride ，TG)、脂褐素、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平。
5．采用WesternBlot方法检测肝脏中自噬分子LC3、Lamp1、Lamp2、p62、Atg5、Atg7、Beclin1蛋白水平；Lipophagy标志物溶酶体PLIN2蛋白水平；调控自噬通路Akt、mTOR、AMPK、ULK1及其相应的磷酸化蛋白水平；以及肝脏和肌肉中成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21，FGF21)蛋白水平。
6．采用ELISA试剂盒检测血清中FGF21和Irisin的水平。
7．采用Q-PCR方法检测肝脏和肌肉中FGF21mRNA水平。
8．采用HepG2细胞和WI-38细胞，建立FFA处理诱导脂肪沉积细胞模型，设对照组给予外源性FGF21以及AMPK分子特异性抑制剂Dorsomorphin，观察FGF21和AMPK信号通路在调控FFA诱导的细胞脂肪沉积的作用机制。
9．采用GFP-RFP-LC3腺病毒感染细胞荧光成像检测自噬通量。
10．采用稳定转染的LC3和LDs特异性染料Bodipy荧光双标成像方法检测Lipophagy。
11．采用LDs特异性染料Bodipy标记荧光成像方法检测LDs累积。
12．同动物实验相类似，采用相应试剂盒检测TG、脂褐素、MDA以及SA-β-gal染色及酶活性。
13．采用WesternBlot方法检测细胞中自噬代表性标志分子LC3、上游关键分子AMPK和ULK1及其磷酸化水平。
结果
1．运动和饮食调节均可以有效改善HFD引起的NAFLD，联合效果更好。
肝组织切片HE染色和油红O染色显示HFD可以显著提高肝脏中LDs的累积，TG水平也相应显著提高。运动和饮食调节均能够有效抑制HFD引发的LDs累积和TG水平的升高，二者联合作用效果更明显。
2．运动和饮食调节均可以显著改善HFD引起的自噬及Lipophagy的抑制，饮食调节主要通过调节Akt/mTOR/ULK1(Ser757)信号通路发挥作用，运动主要激活AMPK/ULK1(Ser555)信号通路而发挥作用。
自噬和Lipophagy标志物检测发现，HFD能够显著抑制肝脏的自噬和Lipophagy，运动和饮食调节均可以显著拮抗HFD对自噬和Lipophagy的抑制作用，二者联合效果更佳。进一步对调控自噬的上游通路进行检测，结果发现，HFD能够激活Akt/mTOR/ULK1(Ser757)通路，饮食调节能够显著抑制这条通路的激活从而提高Lipophagy的水平；运动能够显著激活AMPK/ULK1(Ser555)信号通路，从而提高Lipophagy水平。二者作用殊途同归，所以联合效果更佳。
3．运动能够诱导FGF21大量产生，骨骼肌是主要来源。
血清中FGF21的结果显示所有运动组血液中FGF21水平均显著增加。肝脏和骨骼肌的FGF21蛋白水平检测发现，骨骼肌中FGF21在运动组升高显著，而肝脏中运动组FGF21水平升高不明显。Q-PCR结果也进一步证实了运动引起的骨骼肌中FGF21基因表达水平升高较肝脏中的FGF21基因表达水平升高更加显著。
4．外源性FGF21可以显著激活AMPK/ULK1信号通路依赖的Lipophagy，改善FFA诱导的细胞脂肪沉积。
蛋白WesternBlot结果显示，FFA处理可以显著抑制AMPK在Thr172位点的磷酸化水平、相应的ULK1在Ser555位点的磷酸化水平及自噬LC3II水平。外源性FGF21处理可以显著拮抗FFA引起的这些改变，如果同时给予AMPK抑制剂后FGF21的这些保护作用就基本消失了。GFP-RFP-LC3双标显示的自噬通量以及Bodipy和LC3共定位显示的Lipophagy水平也呈现了与WesternBlot结果相一致的变化。相应的细胞LDs标记和TG水平测定结果显示，FGF21可以显著改善FFA诱导的LDs累积以及TG水平，而AMPK抑制剂共处理可以去除FGF21的这些保护作用。
5．运动和饮食调节均可有效改善HFD引起的肝脏衰老，联合效果更佳。
衰老标志物SA-β-gal、脂褐素、MDA检测结果显示，HFD可以加速肝脏组织的衰老，运动和饮食调节均能够有效降低这些衰老相关指标，改善衰老，二者联合作用效果更好。
6．外源性FGF21可以激活AMPK/ULK1信号通路改善FFA诱导的脂肪沉积，从而改善FFA诱导的细胞衰老。
自噬标志物和通路蛋白结果显示，FFA处理可以显著抑制AMPK/ULK1通路及自噬标志物LC3的水平，外源性FGF21处理可以有效拮抗FFA的这些作用。而AMPK抑制剂共处理可以显著抑制FGF21的这些保护作用，相应的脂肪沉积指标TG水平以及衰老相关标志物SA-β-gal、脂褐素、MDA水平检测结果与上述自噬及通路蛋白变化相一致，FGF21可以显著改善FFA诱导的TG水平及衰老，而AMPK抑制剂共处理可以去除FGF21的这些保护作用。
结论
1．HFD可以引起明显的NAFLD，饮食调节和运动能够通过不同途径共同调节Lipophagy改善NAFLD，并且能够表现出联合作用。其中饮食调节可以通过Akt/mTOR/ULK1(Ser757)信号通路提高Lipophagy，运动可以通过AMPK/ULK1(Ser555)信号通路提高Lipophagy，二者协同作用能够更好地改善NAFLD。
2．运动可以通过刺激肌肉产生肌肉因子FGF21，进入血液循环，远程作用于肝脏，通过激活AMPK/ULK1(Ser555)信号通路提高Lipophagy，从而发挥改善NAFLD的作用。
3．HFD引起的脂肪沉积可以显著加速衰老，饮食调节和运动可以通过提高AMPK/ULK1通路依赖的自噬/Lipophagy改善脂肪沉积，延缓衰老。
非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liverdisease，NAFLD)是全球重大公共卫生事件，严重影响了约10亿人口的身体健康。至今尚未明确其具体的发病机制及临床有效治疗药物，因此深入探讨NAFLD的发病机理，寻找可能的潜在干预治疗靶点，将会为临床有效防治NAFLD提供科学依据。
自噬是一种普遍存在的生理过程，是机体细胞为适应恶劣环境及对抗各种应激做出的一种自我保护反应，自噬也参与了众多疾病的发生发展。最新研究进展表明代谢性疾病包括NAFLD等脂肪堆积过程中的脂代谢紊乱与自噬障碍密切相关，激活自噬能够改善脂质代谢紊乱。Lipophagy是一种选择特异性自噬，是脂滴(Lipid droplets，LDs)和胆固醇(Cholesterol，CHOL)被自噬体选择性吞噬并传递给溶酶体，融合后在酸性脂肪酶和水解酶相互作用下将LDs分解为甘油和游离脂肪酸(Free fatty acids，FFA)的一种细胞内降解脂肪的途径，以此去除多余的脂质来保护细胞免受脂毒性侵害。已有研究表明，Lipophagy能有效降解LDs来调节细胞内的脂代谢水平，改善肥胖症的严重程度。但Lipophagy是否能够作为防治NAFLD的一个潜在干预靶点仍不清楚。运动和饮食调节是代谢性相关疾病的常用干预手段，那么它们是否能够通过调控Lipophagy来改善NAFLD，其内在的分子机制如何，以及二者的干预机制是否有交集等仍不清楚。
为了验证上述这些问题，我们体内采用由高脂膳食(High fat diet，HFD)诱导大鼠的NAFLD模型和体外采用的FFA诱导的细胞脂肪沉积模型，从对Lipophagy的调控机制角度探讨运动和饮食调节对HFD引起的NAFLD以及肝脏衰老的改善作用及机制，为将来临床制定NAFLD及其引起的相关疾病的防治策略提供实验室依据。
目的
通过HFD诱导的大鼠NAFLD模型及FFA诱导的细胞脂肪沉积模型，研究运动和饮食调节对HFD引起NAFLD及肝脏衰老的保护作用，并阐明Lipophagy及其上游的信号通路在此过程中的作用和机制。
方法
1．SD大鼠给予HFD3个月建立动物NAFLD模型，建模成功后，设对照组，将动物分为Chow、HFD、HFD+Exercise、HFD-Chow和HFD-Chow+Exercise五组，其中HFD-Chow为由高脂饲料改为常规普通饲料，Exercise为按照设计完成规定的运动，继续喂养2个月。
2．对肝组织切片进行HE和油红O染色以观察病理学改变及LDs累积情况。
3．采用试剂盒检测肝组织切片SA-β-gal染色及酶活性。
4．采用试剂盒检测肝组织甘油三酯(Triglyceride ，TG)、脂褐素、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平。
5．采用WesternBlot方法检测肝脏中自噬分子LC3、Lamp1、Lamp2、p62、Atg5、Atg7、Beclin1蛋白水平；Lipophagy标志物溶酶体PLIN2蛋白水平；调控自噬通路Akt、mTOR、AMPK、ULK1及其相应的磷酸化蛋白水平；以及肝脏和肌肉中成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21，FGF21)蛋白水平。
6．采用ELISA试剂盒检测血清中FGF21和Irisin的水平。
7．采用Q-PCR方法检测肝脏和肌肉中FGF21mRNA水平。
8．采用HepG2细胞和WI-38细胞，建立FFA处理诱导脂肪沉积细胞模型，设对照组给予外源性FGF21以及AMPK分子特异性抑制剂Dorsomorphin，观察FGF21和AMPK信号通路在调控FFA诱导的细胞脂肪沉积的作用机制。
9．采用GFP-RFP-LC3腺病毒感染细胞荧光成像检测自噬通量。
10．采用稳定转染的LC3和LDs特异性染料Bodipy荧光双标成像方法检测Lipophagy。
11．采用LDs特异性染料Bodipy标记荧光成像方法检测LDs累积。
12．同动物实验相类似，采用相应试剂盒检测TG、脂褐素、MDA以及SA-β-gal染色及酶活性。
13．采用WesternBlot方法检测细胞中自噬代表性标志分子LC3、上游关键分子AMPK和ULK1及其磷酸化水平。
结果
1．运动和饮食调节均可以有效改善HFD引起的NAFLD，联合效果更好。
肝组织切片HE染色和油红O染色显示HFD可以显著提高肝脏中LDs的累积，TG水平也相应显著提高。运动和饮食调节均能够有效抑制HFD引发的LDs累积和TG水平的升高，二者联合作用效果更明显。
2．运动和饮食调节均可以显著改善HFD引起的自噬及Lipophagy的抑制，饮食调节主要通过调节Akt/mTOR/ULK1(Ser757)信号通路发挥作用，运动主要激活AMPK/ULK1(Ser555)信号通路而发挥作用。
自噬和Lipophagy标志物检测发现，HFD能够显著抑制肝脏的自噬和Lipophagy，运动和饮食调节均可以显著拮抗HFD对自噬和Lipophagy的抑制作用，二者联合效果更佳。进一步对调控自噬的上游通路进行检测，结果发现，HFD能够激活Akt/mTOR/ULK1(Ser757)通路，饮食调节能够显著抑制这条通路的激活从而提高Lipophagy的水平；运动能够显著激活AMPK/ULK1(Ser555)信号通路，从而提高Lipophagy水平。二者作用殊途同归，所以联合效果更佳。
3．运动能够诱导FGF21大量产生，骨骼肌是主要来源。
血清中FGF21的结果显示所有运动组血液中FGF21水平均显著增加。肝脏和骨骼肌的FGF21蛋白水平检测发现，骨骼肌中FGF21在运动组升高显著，而肝脏中运动组FGF21水平升高不明显。Q-PCR结果也进一步证实了运动引起的骨骼肌中FGF21基因表达水平升高较肝脏中的FGF21基因表达水平升高更加显著。
4．外源性FGF21可以显著激活AMPK/ULK1信号通路依赖的Lipophagy，改善FFA诱导的细胞脂肪沉积。
蛋白WesternBlot结果显示，FFA处理可以显著抑制AMPK在Thr172位点的磷酸化水平、相应的ULK1在Ser555位点的磷酸化水平及自噬LC3II水平。外源性FGF21处理可以显著拮抗FFA引起的这些改变，如果同时给予AMPK抑制剂后FGF21的这些保护作用就基本消失了。GFP-RFP-LC3双标显示的自噬通量以及Bodipy和LC3共定位显示的Lipophagy水平也呈现了与WesternBlot结果相一致的变化。相应的细胞LDs标记和TG水平测定结果显示，FGF21可以显著改善FFA诱导的LDs累积以及TG水平，而AMPK抑制剂共处理可以去除FGF21的这些保护作用。
5．运动和饮食调节均可有效改善HFD引起的肝脏衰老，联合效果更佳。
衰老标志物SA-β-gal、脂褐素、MDA检测结果显示，HFD可以加速肝脏组织的衰老，运动和饮食调节均能够有效降低这些衰老相关指标，改善衰老，二者联合作用效果更好。
6．外源性FGF21可以激活AMPK/ULK1信号通路改善FFA诱导的脂肪沉积，从而改善FFA诱导的细胞衰老。
自噬标志物和通路蛋白结果显示，FFA处理可以显著抑制AMPK/ULK1通路及自噬标志物LC3的水平，外源性FGF21处理可以有效拮抗FFA的这些作用。而AMPK抑制剂共处理可以显著抑制FGF21的这些保护作用，相应的脂肪沉积指标TG水平以及衰老相关标志物SA-β-gal、脂褐素、MDA水平检测结果与上述自噬及通路蛋白变化相一致，FGF21可以显著改善FFA诱导的TG水平及衰老，而AMPK抑制剂共处理可以去除FGF21的这些保护作用。
结论
1．HFD可以引起明显的NAFLD，饮食调节和运动能够通过不同途径共同调节Lipophagy改善NAFLD，并且能够表现出联合作用。其中饮食调节可以通过Akt/mTOR/ULK1(Ser757)信号通路提高Lipophagy，运动可以通过AMPK/ULK1(Ser555)信号通路提高Lipophagy，二者协同作用能够更好地改善NAFLD。
2．运动可以通过刺激肌肉产生肌肉因子FGF21，进入血液循环，远程作用于肝脏，通过激活AMPK/ULK1(Ser555)信号通路提高Lipophagy，从而发挥改善NAFLD的作用。
3．HFD引起的脂肪沉积可以显著加速衰老，饮食调节和运动可以通过提高AMPK/ULK1通路依赖的自噬/Lipophagy改善脂肪沉积，延缓衰老。