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.研究目的骨骼肌急性损伤是各种体育运动损伤的常见形式。在损伤后浸润至损伤部位的中性粒细胞和巨噬细胞协同PD-1等免疫抑制因子调控骨骼肌损伤后的修复再生。研究发现,PD-1可通过调控M1型和M2型巨噬细胞的表型转换,促进损伤骨骼肌的修复再生。而IFN-γ作为M1型巨噬细胞的主要诱导因子,可促进巨噬细胞向M1型极化,加重炎症反应,在体外抑制肌细胞的增殖与分化。然而,关于PD-1与IFN-γ的相互作用调控骨骼肌损伤再生的具体机制尚不清楚。因此,本研究旨在探索PD-1与IFN-γ对损伤骨骼肌中中性粒细胞和巨噬细胞的调控作用,进而探究其影响骨骼肌损伤修复再生的作用与机制。.研究方法本研究分别采用PD-1基因敲除和IFN-γ抗体阻断的方式对C57BL/6小鼠体内的PD-1和IFN-γ进行了特异性抑制,并通过用心脏毒素诱导胫骨前肌损伤的方式构建了骨骼肌急性损伤模型。30只野生型C57BL/6小鼠被随机分为野生型未损伤组（WTsham,n=6）、野生型生理盐水注射损伤组（WTNS,n=12）和野生型 Anti-IFN-γ 抗体注射损伤组（WTAnti-IFN-γ,n=12）。30 只 PD-1 敲除 C57BL/6小鼠被随机分为PD-1敲除未损伤组（PSham,n=6）、PD-1敲除生理盐水注射损伤组（PNS,n=12）和 PD-1 敲除 Anti-IFN-γ 抗体注射损伤组（PAnti-IFN-γ,n=12）。同时,将各损伤组随机分为伤后3天组和伤后14天组,每组6只。在骨骼肌损伤后的第3天和第14天取小鼠双侧胫骨前肌与未损伤小鼠进行比较。使用HE染色观察损伤和再生骨骼肌形态变化;Masson染色观察骨骼肌纤维化情况;RT-PCR检测促炎因子、抗炎因子、纤维化相关因子和生肌调节因子的表达情况;Western Blot和RT-PCR检测巨噬细胞及其亚型标记物变化;免疫荧光检测总巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞和中性粒细胞的浸润情况。.研究结果1.骨骼肌损伤后PD-1与IFN-γ的表达上调荧光定量PCR结果显示,普通野生型小鼠的PD-1和IFN-γ表达水平在骨骼肌损伤后显著上调,于损伤后第3天达到高峰（P＜0.01）,至第14天回落至初始水平。而PD-1敲除小鼠的IFN-γ表达水平在骨骼肌损伤后的第3天和第14天都显著高于普通野生型小鼠（P＜0.01）。2.敲除PD-1及阻断IFN-γ加剧骨骼肌损伤HE染色结果显示,在CTX造成胫骨前肌损伤后第3天,WTNS、WTAnti-IFN-γ、PNS和PAnti-IFN-γ组均出现大量炎性细胞浸润迁移至损伤区域,骨骼肌细胞大量肿胀坏死。WTNS组胫骨前肌中炎性细胞浸润面积约为40%,显著小于WTAnti-IFN-γ组和PNS组（约为60%）（P＜0.01）,仍存有大量完整的骨骼肌细胞。PAnti-IFN-γ组胫骨前肌中炎性细胞浸润面积最大,靠近80%,显著大于WTAnti-IFN-γ组和PNS组（P＜0.05）,且骨骼肌细胞大量坏死溶解,完整肌细胞所剩无几,损伤最为严重。3.敲除PD-1及阻断IFN-γ损害骨骼肌再生HE染色结果显示,在CTX造成胫骨前肌损伤后第14天,WTNS、WTAnti-IFN-γ、PNS和PAnti-IFN-γ组损伤部位均出现大量中央成核的再生肌纤维,且再生肌纤维直径大小不一。WTNS组的再生肌纤维直径显著大于WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）和PNS组（P＜0.01）。PAnti-IFN-γ组的再生肌纤维直径显著小于PNS组（P＜0.01）,而与WTAnti-IFN-γ组相比无显著差异（P＞0.05）。荧光定量PCR结果显示,在损伤后第3天和第14天,WTNS组的Myogenin mRNA表达水平都显著高于WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）和 PNS组（P＜0.01）,而 PAnti-IFN-γ组的 Myogenin mRNA表达水平在骨骼肌损伤后第3天显著低于WTAnti-IFN-γ（P＜0.05）和PNS组（P＜0.01）。在损伤后第14天,PAnti-IFN-γ组的Myogenin mRNA表达水平显著低于PNS组（P＜0.05）,与WTAnti-IFN-γ组相比无显著差异（P＞0.05）。4.敲除PD-1及阻断IFN-γ加剧骨骼肌纤维化Masson染色结果显示,在胫骨前肌损伤后第14天,WTNS组的胶原纤维沉积面积显著小于 WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）和 PNS 组（P＜0.01）。PAnti-IFN-γ 组的胶原纤维沉积面积显著大于PNS组（P＜0.01）,而与WTAnti-IFN-γ组相比无显著性差异（P＞0.05）。荧光定量PCR结果显示,在胫骨前肌损伤后第3天,WTNS组的Col3al、TGF-β mRNA 表达显著低于 WTAnti-IFN-γ（P＜0.01）和 PNS 组（P＜0.01）。而 PAnti-IFN-γ 组的 Col3a1、TGF-β mRNA 表达显著高于 PNS 组（P＜0.01）。此外,PAnti-IFN-γ 组的 TGF-β mRNA 表达还显著高于 WTAnti-IFN-γ 组（P＜0.01）。在胫骨前肌损伤后第14天,WTNS组的Col3a1 mRNA表达显著低于 WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）和 PNS组（P＜0.01）,而 PAnti-IFN-γ组的 Col3al、TGF-β mRNA表达显著高于PNS组（P＜0.05）。而且,PAnti-IFN-γ组的TGF-β mRNA表达还显著高于WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）。5.敲除PD-1及阻断IFN-γ加剧骨骼肌炎症反应荧光定量PCR结果显示,在胫骨前肌损伤后第3天,WTNS组的促炎因子IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 表达显著低于 WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）和 PNS 组（P＜0.05）。PAnti-IFN-γ组的 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 表达显著高于 WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）和PNS组（P＜0.01）。在胫骨前肌损伤后第14天,PAnti-IFN-γ组的 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 表达显著高于 WTAnti-IFN-γ组（P＜0.05）,而且其IL-6 mRNA表达还显著高于PNS组（P＜0.01）。对于抗炎因子IL-10的结果比较显示,在胫骨前肌损伤后的第3天,WTNS组的IL-10 mRNA表达显著高于WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）和 PNS 组（P＜0.01）。PAnti-IFN-γ组IL-10 mRNA 表达显著低于WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）,而与PNS组相比无显著差异（P＞0.05）。而且,IL-10 mRNA表达在胫骨前肌损伤后的第14天于各组之间比较无显著差异（P＞0.05）。6.骨骼肌损伤后阻断IFN-γ抑制巨噬细胞的浸润Western Blot结果显示,在胫骨前肌损伤后第3天,PAnti-IFN-γ组的Mac-2蛋白表达显著低于PNS组（P＜0.05）。荧光定量PCR结果显示,在胫骨前肌损伤后第 3 天,WTAnti-IFN-γ组的 Mac-2、F4/80 和 CD68 mRNA 表达均显著低于 WTNS组（P＜0.01）。PAnti-IFN-γ组的 Mac-2、F4/80 和 CD68 mRNA 表达均显著低于 PNS组（P＜0.01）,而其 CD68 mRNA 表达显著高于 WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）。在胫骨前肌损伤后第14天,WTNS组的F4/80和CD68 mRNA表达显著高于WTAnti-IFN-γ组（P＜0.05）。PAnti-IFN-γ组的 Mac-2、F4/80 和 CD68 mRNA 表达均显著高于WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）。7.敲除PD-1及阻断IFN-γ对M1型巨噬细胞的影响免疫荧光结果显示,在胫骨前肌损伤后第3天,PAnti-IFN-γ组的M1型巨噬细胞数量显著多于WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）和PNS组（P＜0.01）。同时,WTNS组的M1型巨噬细胞数量显著少于PNS组（P＜0.01）。对M1型巨噬细胞标记物iNOS和CD86的荧光定量PCR结果显示,在胫骨前肌损伤后第3天,WTNS组的M1型巨噬细胞标志物iNOS和CD86的mRNA表达显著低于PNS组（P＜0.05）,而其 iNOS 的 mRNA 表达显著高于 WTAnti-IFN-γ组（P＜0.05）。同时,PAnti-IFN-γ组的iNOS 和 CD86 mRNA 表达显著高于 WTAnti-IFN-γ 组（P＜0.01）和 PNS 组（P＜0.05）。8.敲除PD-1及阻断IFN-γ对M2型巨噬细胞的影响免疫荧光结果显示,在胫骨前肌损伤后第3天,PAnti-IFN-γ组的M2型巨噬细胞数量显著少于WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）和PNS组（P＜0.01）。同时,WTNS组的M2型巨噬细胞数量显著多于WTAnti-IFN-γ组（P＜0.05）和PNS组（P＜0.01）。对于M2型巨噬细胞标记物Arg1和CD206的RT-PCR结果显示,在胫骨前肌损伤后第 3 天,PAnti-IFN-γ组的 Arg1 和 CD206 mRNA 表达显著低于 PNS组（P＜0.05）,而 WTNS 组的 CD206 mRNA 表达显著高于 WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）和 PNS 组（P＜0.01）。在胫骨前肌损伤后第14天,WTAnti-IFN-γ组和PAnti-IFN-γ组的Arg1 mRNA表达分别显著高于WTNS组（P＜0.01）和PNS组（P＜0.01）。同时,PAnti-IFN-γ 组的 CD206 mRNA 表达显著高于 WTAnti-IFN-γ 组（P＜0.05）和 PNS 组（P＜0.01）。9.敲除PD-1及阻断IFN-γ对中性粒细胞的影响免疫荧光结果显示,在胫骨前肌损伤后第3天,WTNS组的中性粒细胞数量显著少于 WTAnti-IFN-γ组（P＜0.01）和 PNS 组（P＜0.05）,而 PAnti-IFN-γ组的中性粒细胞数量显著多于PNS组（P＜0.05）,而与WTAnti-IFN-γ组相比无显著差异（P＞0.05）。在胫骨前肌损伤后的第14天,各组均无中性粒细胞浸润。.研究结论PD-1基因敲除后阻断IFN-γ信号并没有改善骨骼肌损伤,也没有促进其再生,反而通过增加中性粒细胞浸润,阻碍总巨噬细胞浸润和抑制M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化加剧骨骼肌炎症反应,加重骨骼肌损伤,阻碍其再生,促进其纤维化。