近年来，有研究发现NGAL(neutrophil gelatinase—associated lipocalin)可能是人类的一种新的癌基因，在食管上皮细胞癌变等过程中显著过表达，但表达调控机制不清。序列分析发现，在NGAL基因5’侧翼转录调控区有典型的转录激活因子NF-κB(nuclear factor kappa B)的结合元件(GGGAATGTCC，-180～-171bp)，提示NF-κB因子可能参与食管上皮细胞癌变等过程中NGAL基因表达的调控。 NF-κB是一类普遍存在的转录因子家族，目前已从中鉴定出了十几个成员，分别在不同的组织或阶段，依时空特异性参与着150余种基因的转录调控，主要涉及免疫炎症反应、细胞凋亡以及肿瘤的发生、浸润、转移和耐药等。那么在食管上皮细胞癌变等过程中，究竟有哪些NF-κB因子参与作用，其中是否有一些尚未被鉴定的新NF-κB因子存在?为此，本研究通过酵母单杂交等技术手段在食管癌细胞cDNA酵母杂交文库中对NF-κB因子进行了初步的筛选与鉴定，以期为阐明NGAL基因在食管上皮细胞癌变等过程中显著过表达提供理论依据。 主要研究内容与方法： 一、设计并合成诱饵片段，定向插入DNA-BD载体，通过限制性内切酶酶切和DNA测序的方法鉴定正确重组子。 二、将携带正确诱饵片段的重组子转入酵母细胞株YM4271中，通过严格的3-AT抑制试验获得酵母单杂交宿主细胞，为筛库做准备。 三、筛选食管癌细胞系SHEEC的cDNA酵母杂交文库，通过反复营养缺陷培养和3-AT加压的方法收获启动报告基因表达的阳性候选克隆。 四、抽提酵母阳性候选克隆的质粒，转化大肠杆菌后获得单一文库质粒；将纯化的单一文库质粒再次转入酵母单杂交宿主细胞，在酵母体内一对一验证激活报告基因的作用。 五、对酵母体内一对一验证的阳性克隆进行DNA测序。 六、对DNA测序结果进行鉴定和初步的生物信息学分析。 研究结果： 一、合成了三重NF-κB位点寡核苷酸串正反链，退火后，定向插入DNA-BD载体，筛选鉴定，获得了携带诱饵片段的重组子。 二、将携带正确诱饵片段的重组子转入酵母细胞株YM4271中，在严格的3-AT汕头大学医学院硕士学位论文压力下获得了基因组上整合有诱饵片段的酵母单杂交宿主细胞。 三、在SHEEC人食管癌细胞系cDNA酵母杂交文库中进行筛查，获得了阳性候选克隆351个。 四、对上述阳性候选酵母细胞克隆进行了质粒的提取与酶切鉴定，获得真正插入外源片段的阳性克隆37个。 五、对上述37个阳性克隆在酵母细胞体内进行一对一验证，其中31个被证实有激活报告基因的作用。 六、对上述31个阳性克隆进行了DNA测序，并给予鉴定分类;在此基础上，对部分结果进行了初步的生物信息学分析，发现与以往的p50或p65等NF一KB因子的结构不同。 结论: 一、成功建立了酵母单杂交实验技术平台。 二、从设计合成诱饵片段开始，经过诱饵载体构建、与宿主酵母菌细胞染色体整合、筛库、质粒提取与酶切鉴定、酵母细胞体内一对一验证以及DNA测序鉴定分类和初步的生物信息学分析等，结果提示，在食管癌细胞中可能存在着某种结构的NF一KB因子，而且可能是新结构。 三、有关NF一KB因子家族在相关基因表达调控中发挥作用是一个复杂的问题。通过本研究，在食管癌细胞中针对NGAL基因表达调控这一侧面获得了一些初步结果。今后拟采取诸如凝胶阻滞等多种实验手段，围绕进一步验证结果、排除假象开展研究。 然而，无论如何，上述结果所展示出来的实验事实都将提示我们NF一KB因子途径在食管上皮细胞癌变等过程中调控NGAL基因表达值得深入研究。