【摘 要】
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奶牛胎衣不下（RFM）是一种常见的产后繁殖障碍性疾病。本团队前期的研究结果表明,RFM的发生与机体的氧化应激状态、细胞凋亡及细胞外基质（ECM）降解程度有关。非酯化脂肪酸（NEFA）是围产期奶牛处于能量负平衡（NEB）时血中浓度会升高的一种脂质代谢物质。已有国内外的多个研究发现围产期高NEFA血症会增加RFM的发病率,且NEFA参与调节ECM的重塑。因此本实验拟通过体外模拟高NEFA血症,用不同浓
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奶牛胎衣不下（RFM）是一种常见的产后繁殖障碍性疾病。本团队前期的研究结果表明,RFM的发生与机体的氧化应激状态、细胞凋亡及细胞外基质（ECM）降解程度有关。非酯化脂肪酸（NEFA）是围产期奶牛处于能量负平衡（NEB）时血中浓度会升高的一种脂质代谢物质。已有国内外的多个研究发现围产期高NEFA血症会增加RFM的发病率,且NEFA参与调节ECM的重塑。因此本实验拟通过体外模拟高NEFA血症,用不同浓度的NEFA刺激奶牛子宫内膜上皮细胞,应用生物化学和分子生物学等方法确定NEFA与RFM发生之间的相关性,阐明NEB奶牛高NEFA血症通过抑制ECM降解引发RFM发生的作用机制。为运用营养代谢调控技术靶向调节ECM降解防治奶牛产后RFM提供理论基础和实验支撑,进一步揭示围产期奶牛NEB与RFM的内在联系。本实验在筛选细胞营养液中NEFA的最适添加浓度和时间后,将实验分为三组:对照组（0 m M）、低浓度组（0.2 m M）和高浓度组（1.2 m M）。用三组不同浓度的NEFA去刺激奶牛子宫内膜上皮细胞12 h,通过ELISA法检测细胞中GSH、GSH-Px、SOD、MDA的含量,流式细胞术测定ROS的含量,荧光显微镜观察Nrf2的入核情况,来确定NEFA对子宫内膜上皮细胞氧化应激状态的影响。采用流式细胞术检测细胞凋亡率,q RT-PCR和western blot法检测线粒体凋亡通路相关因子caspase-3、caspase-8、Bax、Bcl-2的表达水平,JC-10法测定线粒体膜电位的变化,来确定NEFA是否通过线粒体途径诱导子宫内膜上皮细胞凋亡。最后通过应用q RT-PCR和western blot法检测MMP-2、MMP-9、COL-Ⅳ、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平,来确定NEFA对胶原蛋白降解及炎性反应相关因子的影响。结果:三组不同浓度的NEFA刺激子宫内膜上皮细胞12 h后,高浓度组与对照组和低浓度组相比,GSH、GSH-Px和SOD的含量均下降,其中GSH和GSH-Px的含量极显著降低（P＜0.01）,SOD的含量显著降低（P＜0.05）。而高浓度组MDA的含量与对照组相比则极显著升高（P＜0.01）。高浓度组的细胞内ROS含量极显著高于对照组（P＜0.01）,显著高于低浓度组（P＜0.05）;Nrf2在三组中都有入核现象,且随着NEFA浓度的升高,Nrf2的核内积累也愈发明显。高浓度组在刺激12 h后的细胞凋亡率极显著高于对照组和低浓度组（P＜0.01）。JC-10检测线粒体膜电位发现高浓度组的红色/绿色荧光的比值均极显著低于对照组和低浓度组（P＜0.01）。q RT-PCR和western blot的结果显示,与对照组和低浓度组相比,caspase-3、caspase-8、Bax的m RNA表达在高浓度组时均极显著升高（P＜0.01）,Bcl-2的m RNA表达水平在高浓度组时显著下降（P＜0.05）;caspase-3、caspase-8、Bax和Bcl-2的蛋白表达水平在高浓度组时均极显著高于对照组和低浓度组（P＜0.01）。Bax/Bcl-2的蛋白相对表达量只在低浓度组时极显著高于对照组（P＜0.01）,高浓度组相较于低浓度组的相对表达反而极显著下降（P＜0.01）,且与对照组相比无显著变化（P＞0.05）。MMP-2和COL-Ⅳ的m RNA表达在低浓度和高浓度时被极显著上调（P＜0.01）,高浓度组MMP-9的m RNA表达与对照组和低浓度组相比,均被极显著下调（P＜0.01）;与对照组和低浓度组相比,MMP-2和COL-Ⅳ的蛋白表达均在高浓度时极显著上升（P＜0.01）,而MMP-9的蛋白表达在高浓度组时极显著下降（P＜0.01）。炎性因子中,高浓度组的IL-1β的m RNA表达水平与对照组相比极显著上调（P＜0.01）,与低浓度组相比显著上调（P＜0.05）。IL-6的m RNA表达在低浓度组和高浓度组时相较于对照组均极显著上升（P＜0.01）。高浓度组IL-8的m RNA表达水平与对照组和低浓度组相比均极显著上调（P＜0.01）。与对照组相比,TNF-α的m RNA表达在低浓度组时显著上调（P＜0.05）,在高浓度组时极显著上调（P＜0.01）。通过以上实验结果可知,高浓度NEFA可以诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化应激并通过线粒体凋亡途径诱导细胞发生凋亡,还可以通过诱导细胞炎症反应加重从而降低MMPs的表达,使胶原分解障碍,进而阻碍ECM的降解。综上所述,高NEFA血症可以通过引起子宫内膜上皮细胞过度凋亡和降低胶原分解能力引起ECM降解障碍,最终影响胎衣外排而诱导RFM的发生。
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