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目的： 筛选出对新生儿单个核细胞具有较强免疫增强作用的CpG特征序列，即含非甲基化CpG二核苷酸的寡脱氧核苷酸链(oligodeoxynucleotides，CpG ODN)；采用分子偶联技术合成CpG复合物{CD40L(CD40 ligand，CD40配体)-EDC{1-Ethyl-3[(3-aimethylamino)propyl]carbo-diimide methiodide，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)-pLL(poly-l-lysine，多聚赖氨酸)-CpG ODN}，提高细胞对CpG ODN的摄取率，增强CpG ODN的免疫刺激活性。 方法： 1．根据CpG ODN的结构特点，设计合成15条CpG ODN序列，以国外筛选出的对人具有明显免疫增强作用的CpG2006和国内筛选出的T8为阳性对照，免疫新生儿脐血单个核细胞，MTT法检测CpG ODN对单个核细胞的刺激增殖作用。 2．利用分子偶联技术合成CpG2006复合物 采用国内外公认的对人具有明显免疫增强作用的CpG2006，通过分子偶联技术合成CpG2006复合物(CD40L-pLL-CpG2006)。交联剂碳二亚胺(EDC)促进CD40配体(CD40L)与多聚赖氨酸(pLL)脱水缩合形成带正电荷的CD40L-pLL，CD40L-pLL与带负电荷的CpG2006通过静电作用形成CpG2006复合物(CD40L-pLL-CpG2006)。MTT法检测CpG2006复合物对新生儿单个核2004届硕士学位论文摘要细胞的免疫刺激增殖作用;EUSA法检测细胞分泌IgG抗体的水平;流式细胞仪检测单个核细胞对epo2006的摄取率，分析CD19、CD20、CD22及CD3的表达水平。 3.比较cpG2006复合物、CpGI复合物和CpG6复合物的免疫刺激活性 将筛选出的对新生儿具有较强免疫刺激作用的CpGI和CpG6，利用分子偶联技术合成epGx复合物(CD40L一pLL一CpGI)和CpG6复合物(CD4oL一pLL一CpG6)，以CpGZo06复合物(CD4oL一pLL一CpGZoo6)为对照，免疫新生儿单个核细胞，比较三者的免疫刺激活性。结果: 1.CpGI和CpG6对新生儿单个核细胞的刺激增殖作用强于TS，与CpGZO06相当。 2.合成epG2006复合物(CD4oL一pLL一CpG2006) 3.5%sDs一PAGE显示CD40L一pLL滞留于上样孔中，在CD40L水平上未见条带;1%琼脂糖电泳发现20“Ll:16稀释的CD40L一pLL与10协L(浓度165林g/mL)的CpG20O6均匀混合后，全部滞留于上样孔中，在CpGZO06水平上未见条带，未见向负极的拖带。 单个核细胞对CpG20o6复合物组中CpG2006的摄取率明显高于CpG2006组(P<0.05);以MTT法检测的吸光值A为指标观察单个核细胞的增殖情况，CpGZoo6复合物组的吸光值A(1 .700士0.256)高于CpGZo06组(1 .210士0.497)，两组间差异显著(尸<0.05);CpG2006复合物组IgG抗体浓度(林g/mL)(225.9士89.83)高于CpG2006组(160.9士15.16)，但二者间差异不显著(P>0.os):epoZoo6复合物组中CD19+细胞占单个核细胞的比例为59.05%，eDZo十、eD22十细胞比例高于90%，Cpo2006组中eD19+细胞为14.28%，CD20十、CD22+细胞所占比例均低于11%;两组中CD3十细胞的比例没有明显差异。 3.cpGZo06复合物、CpGI复合物和CpG6复合物的免疫刺激活性 单个核细胞对epoZoo6复合物组(CD40L一pLL一CpGZoo6)、CpGI复合物组 (eD4oL一pLL一CpGI)和CpG6复合物组(CD4oL一pLL一CpG6)中CpGZoo6、CpGI和cpG6的摄取率均高于80%，组间无明显差别;单个核细胞对CpG6组中CpG62004届硕士学位论文摘要的摄取率均高于单个核细胞对CpGZO06组中CpGZo06的摄取率和单个核细胞对CpGI组中CpGI的摄取率。 CpGZo06复合物组、CpGI复合物组和CpG6复合物组中的CD19+细胞占单个核细胞的比例明显高于CpGZo06组·CpGI组和CpG6组(P<0.os)，CpGI复合物组和CpG6复合物组IgG抗体水平均明显高于CpGI组和cpG6组(P<o.05)。CpGZo06复合物组、CpGI复合物组和CpG6复合物组IL一12抗体水平高于阴性对照组(尸<0 .05)。结论: 1.CpGI、CpG6对新生儿具有较强的免疫刺激作用，CpG6对新生儿B细胞 免疫效果较好 2.采用“分子偶联技术”合成的CpG复合物能提高细胞对CpG ODN的摄 取率，促进B细胞增殖、成熟，提高B细胞分泌抗体的能力。分子偶联 技术是提高靶细胞对CpG ODN摄取率的有效方法 3.CpG6复合物对新生儿免疫刺激作用具有强于CpG2006复合物的趋势