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目的:
柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3，CVB3)属于小RNA病毒科，肠道病毒属，是引起病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)的主要病原体。病毒性心肌炎是一种与病毒感染有关的局限性或弥漫性炎症心肌疾病，多累及儿童和青少年，近年来，其发病率呈逐年增高趋势。目前临床上缺乏低毒有效的治疗药物。因此，探索病毒性心肌炎的发病机制，为临床寻找安全、有效的治疗药物极其重要。
4-叠氮-2-脱氧-2-氟阿拉伯胞苷(4-Azido-2-deoxy-2-fluoroaracytidine，FNC)是一种新型的核苷类似物，对于FNC的抗CVB3活性及作用机制还未有报道。本课题组已通过构建病毒性心肌炎体外细胞模型（HeLa细胞）以及体内Balb/c小鼠动物模型，初步确定FNC具有很好的抗CVB3病毒活性，以及治疗病毒性心肌炎的作用。本课题在前期实验的基础上，通过构建病毒性心肌炎原代乳鼠心肌细胞模型、HeLa细胞模型和病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型，进一步确定FNC抗CVB3的作用，并对其抗病毒的作用机制进行初步探讨，以期找到FNC所作用的具体靶点，为寻找病毒性心肌炎的高效低毒治疗药物奠定基础。
方法:
1.体外实验
(1)药效学实验:
通过CVB3感染生长状态良好的原代乳鼠心肌细胞，建立病毒性心肌炎的原代乳鼠心肌细胞模型，观察细胞病变(CPE)，采用MTT法测定细胞的存活率;采用终点稀释法来测定细胞上清中的病毒滴度;通过ELISA法测定细胞上清中乳酸脱氢酶的含量;通过RT-PCR法测定心肌细胞中病毒VP-1基因的表达水平，以检测FNC体外抗CVB3的活性。
(2)机制研究:
通过CVB3感染生长状态良好的原代乳鼠心肌细胞，建立病毒性心肌炎原代乳鼠心肌细胞模型，通过ELISA法测定FNC对细胞培养上清液中炎性因子IL-4、IL-6和TNF-α分泌情况的影响，采用RT-PCR法，测定FNC对炎性因子(IL-4、IL-6、TNF-α)和NF-κB mRNA表达水平的影响。
通过CVB3感染生长状态良好的HeLa细胞，建立病毒性心肌炎HeLa模型，采用Western Blot法测定FNC对NF-κB通路相关蛋白表达的影响;采用细胞免疫荧光法测定FNC对NF-κB核转移的影响。
2.体内实验
(1)药效学实验:
通过给Balb/c小鼠腹腔注射CVB3病毒构建病毒性心肌炎动物模型，连续灌胃给药7天，观察小鼠一般生存状况，小鼠心肌组织形态学改变，采用RT-PCR法检测小鼠心脏病毒VP-1基因的表达水平，评价FNC对病毒性心肌炎小鼠的治疗作用。
(2)机制研究:
选择FNC的有效剂量进行实验，检测FNC对心脏组织中NF-κB核蛋白表达的影响。
结果:
1.体外实验
(1)药效学实验结果:
FNC具有很好的抗CVB3活性，对CVB3病毒的半数抑制浓度IC50为4.37±0.73ng/ml，治疗指数TI为2.50×105;FNC可以有效的降低CVB3滴度、乳酸脱氢酶的分泌并抑制病毒基因VP-1的表达。
(2)机制研究结果:
在病毒性心肌炎的乳鼠心肌细胞模型中，FNC可抑制细胞上清中IL-4、IL-6和TNF-α的分泌;在基因水平上，FNC对炎症因子IL-4、IL-6、TNF-α和NF-κB的mRNA表达有抑制作用。
在病毒性心肌炎的HeLa细胞模型中，FNC能够有效促进IκBα蛋白的表达并抑制p65和p-p65蛋白表达;免疫荧光实验结果显示FNC能够有效抑制NF-κB转移到细胞核。
2.体内实验
(1)药效学实验结果:
FNC对病毒性心肌炎Balb/c小鼠有明显的治疗作用，能显著改善患病小鼠的一般生存状况，抑制心肌组织中病毒VP-1基因的表达，心肌组织病理切片也显示FNC能明显减轻炎性细胞的浸润和心肌细胞的坏死。
(2)机制研究结果
FNC能抑制心肌组织中NF-κB核蛋白的表达。
结论:
1.FNC在体外和体内水平均具有显著的抗CVB3病毒作用。
2.FNC发挥抗CVB3病毒的作用主要是通过抑制NF-κB信号通路的激活来实现的。
3.FNC对NF-κB信号通路的抑制作用是通过抑制p65-NF-κB的核转移来实现的。
柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3，CVB3)属于小RNA病毒科，肠道病毒属，是引起病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)的主要病原体。病毒性心肌炎是一种与病毒感染有关的局限性或弥漫性炎症心肌疾病，多累及儿童和青少年，近年来，其发病率呈逐年增高趋势。目前临床上缺乏低毒有效的治疗药物。因此，探索病毒性心肌炎的发病机制，为临床寻找安全、有效的治疗药物极其重要。
4-叠氮-2-脱氧-2-氟阿拉伯胞苷(4-Azido-2-deoxy-2-fluoroaracytidine，FNC)是一种新型的核苷类似物，对于FNC的抗CVB3活性及作用机制还未有报道。本课题组已通过构建病毒性心肌炎体外细胞模型（HeLa细胞）以及体内Balb/c小鼠动物模型，初步确定FNC具有很好的抗CVB3病毒活性，以及治疗病毒性心肌炎的作用。本课题在前期实验的基础上，通过构建病毒性心肌炎原代乳鼠心肌细胞模型、HeLa细胞模型和病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型，进一步确定FNC抗CVB3的作用，并对其抗病毒的作用机制进行初步探讨，以期找到FNC所作用的具体靶点，为寻找病毒性心肌炎的高效低毒治疗药物奠定基础。
方法:
1.体外实验
(1)药效学实验:
通过CVB3感染生长状态良好的原代乳鼠心肌细胞，建立病毒性心肌炎的原代乳鼠心肌细胞模型，观察细胞病变(CPE)，采用MTT法测定细胞的存活率;采用终点稀释法来测定细胞上清中的病毒滴度;通过ELISA法测定细胞上清中乳酸脱氢酶的含量;通过RT-PCR法测定心肌细胞中病毒VP-1基因的表达水平，以检测FNC体外抗CVB3的活性。
(2)机制研究:
通过CVB3感染生长状态良好的原代乳鼠心肌细胞，建立病毒性心肌炎原代乳鼠心肌细胞模型，通过ELISA法测定FNC对细胞培养上清液中炎性因子IL-4、IL-6和TNF-α分泌情况的影响，采用RT-PCR法，测定FNC对炎性因子(IL-4、IL-6、TNF-α)和NF-κB mRNA表达水平的影响。
通过CVB3感染生长状态良好的HeLa细胞，建立病毒性心肌炎HeLa模型，采用Western Blot法测定FNC对NF-κB通路相关蛋白表达的影响;采用细胞免疫荧光法测定FNC对NF-κB核转移的影响。
2.体内实验
(1)药效学实验:
通过给Balb/c小鼠腹腔注射CVB3病毒构建病毒性心肌炎动物模型，连续灌胃给药7天，观察小鼠一般生存状况，小鼠心肌组织形态学改变，采用RT-PCR法检测小鼠心脏病毒VP-1基因的表达水平，评价FNC对病毒性心肌炎小鼠的治疗作用。
(2)机制研究:
选择FNC的有效剂量进行实验，检测FNC对心脏组织中NF-κB核蛋白表达的影响。
结果:
1.体外实验
(1)药效学实验结果:
FNC具有很好的抗CVB3活性，对CVB3病毒的半数抑制浓度IC50为4.37±0.73ng/ml，治疗指数TI为2.50×105;FNC可以有效的降低CVB3滴度、乳酸脱氢酶的分泌并抑制病毒基因VP-1的表达。
(2)机制研究结果:
在病毒性心肌炎的乳鼠心肌细胞模型中，FNC可抑制细胞上清中IL-4、IL-6和TNF-α的分泌;在基因水平上，FNC对炎症因子IL-4、IL-6、TNF-α和NF-κB的mRNA表达有抑制作用。
在病毒性心肌炎的HeLa细胞模型中，FNC能够有效促进IκBα蛋白的表达并抑制p65和p-p65蛋白表达;免疫荧光实验结果显示FNC能够有效抑制NF-κB转移到细胞核。
2.体内实验
(1)药效学实验结果:
FNC对病毒性心肌炎Balb/c小鼠有明显的治疗作用，能显著改善患病小鼠的一般生存状况，抑制心肌组织中病毒VP-1基因的表达，心肌组织病理切片也显示FNC能明显减轻炎性细胞的浸润和心肌细胞的坏死。
(2)机制研究结果
FNC能抑制心肌组织中NF-κB核蛋白的表达。
结论:
1.FNC在体外和体内水平均具有显著的抗CVB3病毒作用。
2.FNC发挥抗CVB3病毒的作用主要是通过抑制NF-κB信号通路的激活来实现的。
3.FNC对NF-κB信号通路的抑制作用是通过抑制p65-NF-κB的核转移来实现的。